BMC Medicine Band 20, Artikelnummer: 364 (2022) Diesen Artikel zitierenPatienten mit chronischer Nierenerkrankung haben ein erhöhtes Mortalitätsrisiko, da Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Infektionen die beiden häufigsten Todesursachen für Nierenerkrankungen im Endstadium sind, die mit Hämodialyse (HD) behandelt werden.Die Sterblichkeit durch bakterielle Infektionen bei Huntington-Patienten wird auf 100–1000-mal höher geschätzt als in der gesunden Bevölkerung.Wir haben hochreine zirkulierende Neutrophile von HD und gesunden Spendern umfassend charakterisiert.Proteinspiegel und Transkriptom der Neutrophilen von Huntington-Patienten zeigten eine massive Neutrophilen-Degranulation mit einer dramatischen Verringerung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) während eines oxidativen Ausbruchs und einer defekten oxidativen zellulären Signalübertragung.Darüber hinaus zeigen HD-Neutrophile eine stark beeinträchtigte Fähigkeit, extrazelluläre NET-Bildung (NETosis) in NADPH-Oxidase-abhängigen oder unabhängigen Signalwegen zu erzeugen, was ihren Verlust der Fähigkeit widerspiegelt, extrazelluläre Bakterien abzutöten.Ektopische Wasserstoffperoxidase (H2O2) oder rekombinantes humanes SOD-1 (rSOD-1) stellt teilweise das Ausmaß der HD-dysfunktionalen neutrophilen NET-Bildung wieder her und verbessert es.Unser Bericht ist eines der ersten einzigartigen Beispiele einer schweren und chronischen Beeinträchtigung der NET-Bildung, die zu einer erheblichen klinischen Anfälligkeit für Bakteriämie führt, die höchstwahrscheinlich auf das für Huntington-Patienten typische Stoffwechsel- und Umweltmilieu und nicht auf allgemeine menschliche genetische Mängel zurückzuführen ist.Auf diese Weise könnten eine aberrante Genexpression und unterschiedliche Exozytose unterschiedlicher Körnerpopulationen den chronischen Defekt in der Funktionalität der Neutrophilen und ihre verminderte Fähigkeit, NETosis zu induzieren, widerspiegeln.Daher deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das Targeting von NETose bei Huntington-Patienten Infektionen reduzieren, ihren Schweregrad minimieren und die Sterblichkeitsrate durch Infektionen in dieser Patientenpopulation verringern kann.Die Prävalenz der chronischen Nierenerkrankung (CKD) nimmt weltweit zu [1].Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz (ESRD), die mit Hämodialyse (HD) behandelt werden, haben ein deutlich erhöhtes Risiko für lebensbedrohliche Infektionen [2, 3].Die 3-Jahres-Sterblichkeitsrate bei Patienten mit ESRD liegt bei etwa 25 % [4], während gleichzeitig Infektionen zu einer erheblichen Morbidität führen und die zweithäufigste Todesursache und die häufigste Ursache für Krankenhausaufenthalte bei Dialysepatienten sind [2, 5] .Wie in den letzten Jahren beobachtet, haben sich die kardiovaskulär bedingten Krankenhausaufenthaltsraten verbessert, aber die infektionsbedingten Krankenhausaufenthaltsraten zeigten weit weniger Fortschritte in der chronischen Huntington-Bevölkerung.Die Sterblichkeitsraten durch Septikämie sind 100- bis 300-mal höher als in der Allgemeinbevölkerung [3,4,5].Tatsächlich haben die American Society of Nephrology (ASN) und das Center for Disease Prevention and Control (CDC) kürzlich eine Initiative angekündigt, die darauf abzielt, die Komplikationen der Infektion bei Patienten zu reduzieren, die eine Huntington-Behandlung erhalten [2].Neutrophile spielen eine entscheidende Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen Bakterien-, Pilz- und Virusinfektionen [6].Es wird angenommen, dass eine beeinträchtigte Neutrophilenfunktion bei Urämie die Anfälligkeit für Infektionen erhöht [5, 7, 8, 9].Wie zuvor gezeigt, zeigen von Huntington-Patienten abgetrennte Neutrophile eine beeinträchtigte oxidative Produktion [10,11,12], eine verringerte chemotaktische Reaktion in vitro [13] und eine verringerte bakterizide Abtötungsfähigkeit [12, 14], während die Menge an Neutrophilen sogar etwas höher ist im Vergleich zu gesunden Probanden.Während die Mechanismen, die für reduzierte Neutrophilenfunktionen verantwortlich sind, nicht gut verstanden sind, wurden mehrere voneinander abhängige Faktoren vorgeschlagen, die zur Neutrophilendysfunktion beitragen, einschließlich Stoffwechselveränderungen, urämische Toxine [11], Unterernährung und Entzündung [10] und das Dialyseverfahren an sich [9].Extrazelluläre Neutrophilenfalle (NETs oder NETosis) ist ein Netzwerk von extrazellulären Chromatinfasern, die an die granulären zytoplasmatischen Proteine ​​von Neutrophilen gebunden sind [15].NETose ist gekennzeichnet durch Dekondensation von intrazellulärem Chromatin und Zerfall der Kernhülle, was die Vermischung des Chromatins mit kationischen antimikrobiellen Molekülen ermöglicht, die aus den Granula stammen [15].Wenn die Plasmamembran schließlich permeabilisiert wird, werden die mikrobiziden extrazellulären Fallen freigesetzt.NETs wurden erstmals 2004 als antibakterielle Abwehrmechanismen beschrieben [16], während ursprüngliche Studien zeigten, dass NETosis eine Form des Zelltods war, die sich von Apoptose unterscheidet und möglicherweise als letzter Ausweg in antimikrobiellen Abwehrstrategien für Neutrophile eingesetzt wird [15, 17].NETose wird durch mikrobielle (Bakterien, Pilze und Viren), entzündliche Zytokine (z. B. IL-8, IFN-ɣ, TNF-α) und endogene „sterile“ Auslöser (z. B. Stickstoffmonoxid, Blutplättchen, Komplement, Mononatriumurat) ausgelöst Kristalle) [18].Da die NET-Bildung ein wesentlicher Mechanismus bei der Wirtsabwehr gegen bakterielle Infektionen ist [15, 16, 19, 20], und das erhöhte Infektionsrisiko bei Huntington-Patienten mehreren Risikofaktoren zugeschrieben wurde, die zur neutrophilen Dysfunktion beitragen, ist die Fähigkeit der Neutrophilen noch nicht vorhanden Huntington-Patienten zur Bildung von NETs und die Mechanismen, die die Dysfunktion der Neutrophilen steuern, sind nicht aufgeklärt.Wir entschieden uns daher, hochreine zirkulierende Neutrophile, die von Huntington- und gesunden Kontrollspendern (HC) isoliert wurden, systematisch zu charakterisieren, um zu versuchen, die molekularen und zellulären Mechanismen aufzudecken, die der Neutrophilen-Dysfunktion bei Huntington-Patienten zugrunde liegen.An dieser Studie nahmen 40 gesunde Kontrollpatienten (HC) und 46 ESRD-Patienten teil;jeder Patient wurde dreimal wöchentlich einer HD unterzogen, und jede Dialysebehandlung dauerte 4 h (Zusatzdatei 1: Tabelle 1).Alle Teilnehmer unterzeichneten ihre Einverständniserklärung zur Blutentnahme unter Genehmigung des institutionellen Helsinki-Komitees (0112-19-EMC).Patienten mit Anzeichen einer akuten Entzündung, Infektion oder Bluttransfusion in den letzten 3 Monaten wurden ausgeschlossen.Blut von allen Spendern (z. B. HC und HD) wurde unmittelbar vor den Ex-vivo-Experimenten gesammelt oder HD-Patienten vor der Dialysesitzung aus der arteriellen Leitung entnommen (unter Verwendung des gleichen Verfahrens).Im Durchschnitt wurden 3 bis 9 ml Blutproben nur mit EDTA-Blutröhrchen entnommen.Für die Neutrophilenisolierung wurde Blut von geschlechts- und altersangepassten Huntington-Patienten vor dem Beginn einer Dialysesitzung und von HC-Probanden entnommen.Humane Neutrophile wurden aus 3 ml bis 20 ml Vollblutproben (je nach gewünschter Zellzahl pro Applikation) in EDTA-Blutentnahmeröhrchen isoliert.Hochreine Neutrophile wurden mit dem EasySep™ Direct Human Neutrophil Isolation Kit (Negative Selektion, Stammzellen-Kit) isoliert.Im Durchschnitt ergibt jedes 1 ml Blut 1,5–1 × 106 Zellen (Zusatzdatei 1: Abb. S1A und S1B).Die Zellen wurden in 2 % FCS in RPMI-Medium (biologische Industrien), ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin/Glutamin, gehalten.Der Grundlinien-Priming- oder Aktivierungsstatus von Neutrophilen wurde bewertet, indem die Geschwindigkeit der extrazellulären ROS-Freisetzung vor oder nach der Induktion mit Phorbolmyristatacetat (PMA) und der Freisetzung von extrazellulärem Superoxid überwacht wurde (Zusätzliche Datei 1: Abb. S1C).Für diese Anwendung wurden 1×105 hochreine Neutrophile aus Vollblutproben von HC- und HD-Patienten isoliert.Die Zellen wurden in einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen mit PBS und 20 mM L-012 (Sigma-Aldrich) mit oder ohne Stimulierung mit 100 nM PMA in einem Gesamtvolumen von 200 &mgr;l bei 37°C ausgesät.Die Raten der Superoxidproduktion wurden mit ELISA-Plattenlesegeräten (SpectraMax Plus 384 Microplate Reader) bei 510 nm für bis zu 30 min überwacht.Für den Echtzeitnachweis der intrazellulären ROS/RNS-Produktion in Neutrophilen verwendeten wir das ROS-ID-Gesamt-ROS/Superoxid-Nachweiskit (ENZ-51010, ENZO Life Sciences).Neutrophile wurden aus Blutproben isoliert, die HC-Patienten und HD-Patienten entnommen wurden.Zellen (2 × 106) wurden auf einem runden 16-mm-Deckglas ausgesät, das mit menschlichem Fibronectin 50 μg/ml (Biological Industries) beschichtet war, und 30 Minuten lang bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert, um eine maximale Zelladhäsion zu erreichen.Das ROS/Superoxid-Nachweisgemisch (2 μl Oxidativer-Stress-Nachweisreagenz (grün) für Gesamt-ROS-Nachweisreagenz und 2 μl Superoxid-Nachweisreagenz (orange)) wurde zu 10 ml 1 × Waschpuffer gegeben.Von diesem Reaktionsgemisch wurden 200 &mgr;l zu jeder Vertiefung für 1 Stunde bei 37°C, 5% CO 2 gegeben.Die Zellen wurden dann zweimal mit 1 × Waschpuffer gewaschen und auf ein Deckglas zur Abbildung mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse), das mit einem standardmäßigen grünen (490/525 nm) und orangen (550/620 nm) Filtersatz ausgestattet war, gelegt.Lipopolysaccharide (LPS) (Sigma-Aldrich) oder PMA wurden direkt zugegeben und Schnappschüsse wurden zu den angegebenen Zeiten (z. B. 0, 15, 30, 45 min) aufgenommen.Alternativ wurden die Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers und des Kits für quantitative Messungen von Superoxiden und H2O2 gemessen;die Proben wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) (NAVIOS Analyzer, Beckman Coulter Inc.) gemessen.Neutrophile wurden aus Blutproben von HC- und HD-Spendern isoliert.Neutrophile (1 × 10 6 ) wurden auf einem runden 16-mm-Deckglas in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und für 2 h bei 37 °C, 5 % CO 2 zur Adhäsion inkubiert.Die Zellen wurden dann mit oder ohne PMA oder LPS (100 ng/ml) oder A23187 für 15 und 240 min induziert.Die Zellen wurden dann mit Paraformaldehyd (PFA, 2 % w/v) für 10 min fixiert, mit PBS gewaschen und mit Triton X-100 (0,1 % v/v) für 5 min permeabilisiert.Die Färbung mit Sytox-Grün erfolgte durch Inkubation für 15–30 min, gefolgt von 2–3-maligem Waschen mit einem phosphatfreien Puffer (Hanks Balanced Salt Solution Kat. Nr. 14025-092).Die Bildgebung wurde unter Verwendung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops (Nikon Eclipse) durchgeführt, das mit einem standardmäßigen grünen (490/525 nm) Filtersatz ausgestattet war.Die Gesamt-RNA wurde aus 6 × 106 hochreinen Neutrophilen-Pellets unter Verwendung des RNAEasy Mini-Kits (QIAGEN) gereinigt, einschließlich des DNASEI-On-Column-Schritts für Anwendungen (z. B. für qPCR-Validierungen oder RNA-seq).Die RNA-Konzentrationen wurden mit einem Qubit 4 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) gemessen, und die RNA-Qualität wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer-System (Agilent) gemessen.RNA-Sequenzierungsbibliotheken wurden unter Verwendung des CEL-Seq2-Protokolls, wie zuvor von Hashimshony [21] beschrieben, mit geringfügigen Modifikationen hergestellt.Anstelle von Einzelzellen als Input wurden 2 ng gereinigte RNA als Input für die Bibliotheksherstellung genommen.Die CEL-Seq2-Bibliotheken wurden auf einem Illumina NextSeq 550-Sequenzer (Illumina) sequenziert.RNA-Messungen, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung wurden vom Technion Genome Center, Technion, Israel, durchgeführt.Die RNA-Seq-Roh-Reads wurden zuerst mit FastQC v0.11.9 qualitätsgeprüft und anschließend mit Trimmomatic [22] v0.39 auf 10 bp getrimmt.Die getrimmten Reads wurden mit STAR [23] v2.604a mit Standardparametern und Quantifizierungsmodus der Genzahlen auf das menschliche Genom (GRCh38.p13) abgebildet.Readcounts pro Gen wurden mit featureCounts v2.0.0 [24] (mit der Option „-t gene“) erstellt.Die differentielle Expressionsanalyse wurde in R (Version 4.1.0) mit dem Paket DESeq2 (v1.32.0) [25] durchgeführt.Beim Vergleich der HD-Gruppe mit der HC-Gruppe wurden Gene mit einer fachen Änderung von mehr als 1,5 (lfc > 0,6) und einem P-Wert von weniger als 0,01 als hochreguliert definiert, und Gene mit einer fachen Änderung von weniger als 0,65 (lfc < –0,6) und P-Wert kleiner als 0,01 wurden als herunterreguliert bestimmt.Plots wurden unter Verwendung von DESeq2- und ggplot2 R-Bibliotheken erstellt.Die Genset-Anreicherungsanalyse wurde mit ShinyGo (v0.66) [26] durchgeführt.Die NETotic-Zellerkennung und -klassifizierung wurden als tiefes bzw. maschinelles Lernmodell in Python implementiert.Der Kürze halber wurde die Instanzzell- und Kernsegmentierung unter Verwendung eines vortrainierten Deep-Learning-Modells durchgeführt.Dann wurden physikalische Merkmale für jede segmentierte Zelle extrahiert, z. B. Umfang, integrierte Dichte, Heywood-Zirkularitätsfaktor und Fläche [27].Die segmentierten Zellen wurden manuell als eine der vier Kategorien von lobulierten, delobulierten, diffusen NETs und gespreizten NETs klassifiziert.Ein überwachtes Modell basierend auf Random Forest Classifier wurde trainiert (70 % der Daten) und validiert, wobei ca.90% Genauigkeit.Das trainierte Modell wurde mit einer vollständigen, automatisierten Pipeline der Zellsegmentierung und -klassifizierung für die Morphologievorhersage kombiniert.Peripheres Blut wurde von HC-Spendern und HD-Patienten in EDTA-Sammelröhrchen abgenommen.Gereinigte neutrophile Zellen wurden mit 5 &mgr;l der folgenden konjugierten Maus-anti-Mensch-monoklonalen Antikörper inkubiert;CD45-PE, CD11b-FITC und CD15(MMA)-FITC wurden von BD Biosciences, CD18-APC (Biolegend) und CD66b-APC (Invitrogen) für 10 min bei RT-Zellen gekauft, bei 1500 U/min für 5 min bei zentrifugiert RT.Die Zellen wurden vor der Analyse mit dem NAVIOS Flow Cytometer Analyzer (Beckman Coulter Inc.) in PBS resuspendiert.Die mittleren Fluoreszenzintensitätssignale (MFI) wurden an mindestens 100.000 Zellen aufgezeichnet.Die Reinheit der Neutrophilen-Isolierung durch Zellsortierung mit negativer Selektion mit magnetischen Beads unter Verwendung des EasySep™ Direct Human Neutrophil Isolation Kit (Negative Selektion, Stammzellen-Kit) wurde gemäß den Kit-Anweisungen unter Verwendung von Anti-CD66b-APC (Invitrogen), CD16+, bewertet (Backman Coulter Inc) (Zusätzliche Datei 1: Abb. S1A).Neutrophile wurden wie oben beschrieben aus Vollblutproben von HC- und HD-Patienten isoliert.Die Zellen wurden bei 2000 U/min für 10 min bei RT zentrifugiert und mit 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen mit einem Endvolumen von 150 &mgr;l ausgesät.Zellüberstände enthalten zellfreie DNA (cfDNA) vor oder nach Zugabe von 100 nM PMA, 2,5 mM A23187 (Sigma) für 3 h bei 37 °C in Zellmedien.Angegebene Einheiten des rekombinanten humanen SOD1-Proteins (Sino Biological) wurden zusammen mit PMA hinzugefügt.cfDNA wurde unter Verwendung eines zuvor beschriebenen schnellen fluorometrischen Assays quantifiziert [16].Kurz gesagt, der nicht zellgängige DNA-bindende Farbstoff Sytox green (Molecular Probes) wurde in einer Endkonzentration von 5 μM hinzugefügt, um extrazelluläre DNA zu 10 μl Zellüberstand nachzuweisen, der die NET-cfDNA enthielt, verdünnt in einem Gesamtvolumen von 200 μl PBS.Als DNA-Standard wurde DNA-Standard (Plasmid-DNA) in einer Gesamt-Endkonzentration zwischen 0,1 und 5 ng/ml verwendet, als Kontrolle wurden nicht stimulierte Neutrophile verwendet.Die Fluoreszenz wurde mit dem Mikrotiterplatten-Lesegerät mit 96 Vertiefungen bei einer Emissionswellenlänge von 535 nm und einer Anregungswellenlänge von 485 nm (infinite 200Pro) gemessen.Jedes Experiment wurde in biologischen Triplikaten für HC oder HD durchgeführt und als Mittelwert –/+ Standardabweichung (SD) von relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) dargestellt.Proteine ​​wurden aus 1,5 × 10 7 Neutrophilen extrahiert, die in 120 &mgr;l Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 1 % SDS, 10 % (v/v) Protease-Inhibitoren (p8340, Sigma-21 Aldrich, MO), 1 % Triton suspendiert waren X100, 150 mM NaCl) und für 30 min auf Eis inkubiert.Die Proteinkonzentrationen wurden für jede Probe mit dem Bradford-Assay (BioRad) bestimmt, und gleiche Proteinbeladungen wurden mit 5 × Laemmle-Probenpuffer für eine Endkonzentration von 1 × ergänzt und 10 min bei 100 °C gekocht.Gesamtzellproteinextrakte wurden über 12 oder 15 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran (Whatman) übertragen.Die Membranen wurden mit 5 % BSA blockiert, mit spezifischen Antikörpern gegen menschliches PAD4 (ab96758; Abcam), Anti-Neutrophilen-Elastase (G-2; SC-55549; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Anti-MPO/Myeloperoxidase (266- 6K1; SC-52707; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), MMP-9 (2C3; SC-21733; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) und das Haushaltsprotein GAPDH (Cell Signaling 2118S) als Ladekontrolle.Die Antikörper wurden in TBST 1 % BSA verdünnt und 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Antikörper, der an pferderötliche Peroxidase (HRP) (Jackson) konjugiert war.Signale wurden in G-Box (Syngene) visualisiert (zusätzliche Datei 2).Humane Neutrophile wurden mit 1 × 10 6 /ml resuspendiert und an Kunststoffplatten in Neutrophilen-Wachstumsmedien angeheftet, die PMA oder 0,03 % H 2 O 2 zum Priming von NETosis enthielten.Nach 30-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde das Medium vorsichtig durch frisches Medium (um Auswirkungen auf das Bakterienwachstum zu vermeiden), mit (extrazelluläres Abtöten) oder ohne (vollständiges Abtöten) Cytochalasin D (10 μg/ml) ersetzt und weitere 15 inkubiert min vor Inkubation mit Bakterien.Um zu zeigen, dass die Abtötung extrazellulärer Bakterien nur durch NETosis erfolgt, wurden Proben mit 100 U/ml RNase und proteinasefreier DNase I (Thermo Scientific) vorinkubiert, um extrazelluläre NETs zu entfernen, bevor Bakterien in einem Verhältnis von 1:1 oder exponentiell hinzugefügt wurden gezüchtete Bakterienkultur von Escherichia coli (E. coli) oder Staphylococcus aureus (S. aureus) in angereichertem bakteriellem Wachstumsmedium Luria Broth (LB).Die Proben wurden dann bei 700 g für 5 min zentrifugiert und bei 37 °C und 5 % CO2 für 1 h inkubiert.Die Experimente wurden durch Reihenverdünnung jeder Probe auf Agarplatten abgeschlossen, was zu einer Berechnung der koloniebildenden Einheit (CFU) für jede Dreifachprobe führte.Die Bakterienabtötung wurde dann in Bezug auf die Anzahl der CFU-Ergebnisse aus der Kontrollprobe der Bakterienkultur berechnet, die allein in Medium ohne Neutrophile für 1 Stunde inkubiert wurde.Die Ergebnisse werden als Abtötungsprozentsatz der gesamten lebenden Bakterien der Kontrollprobe dargestellt und als Mittelwerte –/+ SD von drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt.Die bakteriellen E. coli- und S. aureus-Stammkulturen wurden freundlicherweise von den Clalit Clinical Microbial Labors unseres Instituts im Emek Medical Center zur Verfügung gestellt und von ATCC erworben.Routinemäßige Bluttests von Huntington-Patienten und HC-Spendern wurden aus den elektronischen Krankenakten (EMR) der Patienten gesammelt.Die Messungen wurden als Durchschnitt und SD der Zellzahl pro Mikroliter ausgedrückt.Unterschiede zwischen den Gruppen (z. B. Prädialyse vs. Postdialyse) wurden mittels gepaartem t-Test auf einem Signifikanzniveau von ap < 0,05 getestet.Wir haben das R-Softwareprogramm (2020) für die statistische Analyse verwendet.Als erster Schritt zur systematischen Charakterisierung der Neutrophilenfunktionen bei Huntington-Patienten (Zusätzliche Datei 1: Tabelle 1) untersuchten wir zunächst die homöostatischen Werte von Neutrophilen und Eosinophilen von Huntington-Patienten im Vergleich zu HC.Wir analysierten routinemäßige Bluttests, die bei 40 HD- und 46 HC-Spendern durchgeführt wurden, und fanden keinen statistischen Unterschied zwischen den beiden Gruppen in den Spiegeln zirkulierender Neutrophiler (Abb. 1).Überraschenderweise stellten wir einen 1,88-fachen Anstieg der HD-Eosinophilen im Vergleich zu HC fest, wobei das Neut/Eos-Verhältnis zweimal höher war als die HC-Spiegel (Abb. 1A, B).Als nächstes testeten wir die Möglichkeit, dass Immunzellen während des Hämodialyseverfahrens schwer beschädigt werden könnten.Wir verglichen Bluttests von 42 Huntington-Patienten vor und nach der Dialyse und verglichen die durchschnittlichen Werte von Neutrophilen, Eosinophilen, Lymphozyten und Monozyten.Wir beobachteten keine signifikante Veränderung in allen getesteten Immunzellen (Veränderungen im Bereich zwischen 5 und 15 %) (Abb. 1C, D).Da keine nachweisbaren signifikanten Unterschiede zwischen den homöostatischen Spiegeln von Immunzellen beobachtet wurden, untersuchten wir die Möglichkeit, dass eine chronische Dysfunktion der Immunzellen an der Anfälligkeit von Huntington-Patienten für Infektionen beteiligt sein könnte.Blutplasmabestandteile: in A Neutrophile und Eosinophile, HC-Patienten (n=40) versus HD-Patienten (n=46), in B die Verteilung des Neutrophilen/Eosinophilen-Verhältnisses (als geschätzte Dichte) und die entsprechenden Medianwerte;in C Zählung vor und nach der Dialyse (n=47) von Neutrophilen, Lymphozyten, Monozyten und Eosinophilen, in D die HistogrammeWir etablierten eine Ex-vivo-Sortierung neutrophiler Zellen basierend auf der negativen Selektion von Vollblutzellen [28].Wie zuvor berichtet [28], ergab es ein hochgereinigtes, lebensfähiges, nicht aktiviertes Neutrophilen-Zellpellet (Zusätzliche Datei 1: Abb. S1).Diese überlegene Methode war frei von kontaminierenden Eosinophilen und ermöglichte die Generierung empfindlicher, genauerer molekularer und biochemischer Daten von nicht aktivierten Zellen.Um zu testen, ob neutrophile Zellen von Huntington-Patienten funktionsgestört sind, bewerteten wir die gesamten Gesamtspiegel von neutrophilen Körnerproteinen wie Myeloperoxidase (MPO), neutrophiler Elastase (NE) und Matrix-Metallopeptidase 9 (MMP-9).Diese essentiellen antimikrobiellen Proteine ​​sind hauptsächlich in den Azurophilen oder „primären neutrophilen Granula“ lokalisiert und an vielen antimikrobiellen Abwehrmechanismen beteiligt [29,30,31,32].Beim Vergleich von Proteinextrakten von Neutrophilen, die durch Western Blot (WB) aus HC und HD isoliert wurden, beobachteten wir eine deutliche Depletion von MPO, MMP-9 und NE in von Huntington-Patienten stammenden Zellen (Abb. 2A), wie sie häufig nach Neutrophilen-Degranulation in beobachtet werden wobei die zytoplasmatischen Granula der Neutrophilen mobilisiert werden, um mit der Zellmembran zu verschmelzen, was zur Exozytose löslicher Granula-Proteine ​​und zur Freilegung der Membran an der Zelloberfläche führt.Um die Möglichkeit weiter zu untermauern, dass Huntington-Zellen Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der neutrophilen Zelloberfläche und aufgrund der zytoplasmatischen Körnermobilisierung [33] zeigen können, haben wir die Werte der primären, sekundären und tertiären Körnermarker untersucht [33].CD66b, CD15, CD18 und CD11b auf der neutrophilen Zelloberfläche von HC- und HD-Spendern.Abgesehen von vergleichbaren CD11b-Spiegeln zeigten alle anderen Oberflächenmarker (z. B. CD66b, CD15, CD18) signifikant höhere Intensitäten in HD-Zellen im Vergleich zu HC-Neutrophilen (Abb. 2B).Da berichtet wurde, dass ein fortschreitender Verlust des Granulainhalts und Veränderungen im neutrophilen Transkriptom [34] und Proteom die NET-bildende Kapazität verringern können [35], haben wir eine Reihe von differentiellen Genexpressionsprofilen erstellt, die 7 HC- und 7 HD-Patienten verglichen (Abb. 2C) durch RNA-seq, um zu versuchen, neue intrazelluläre Signalwege, zelluläre Netzwerke oder molekulare Transkriptionsnetzwerke aufzudecken, die eine unzureichende Genexpression in Huntington-Neutrophilen kompensieren.Der Vergleich der Unterschiede in der Genexpression zwischen HD- und HC-Neutrophilen zeigte einen deutlichen Unterschied zwischen den Transkriptionskarten (Abb. 2C und zusätzliche Datei 1: Abb. S2).Überraschenderweise war die Verteilung der unterexprimierten Huntington-Gene entgegen unseren anfänglichen Erwartungen sporadisch ohne signifikante Gentypanreicherung verstreut, während die Huntington-hochregulierten Gene eine fokussierte Klassifizierung in Richtung proteinkodierender Gene zeigten (Abb. 2D und zusätzliche Datei 1: Abb .S2A).Eine eingehende Analyse der HD hochregulierten differentiell exprimierten Gene (zusätzliche Datei 1: Abb. S2B) zeigte eine signifikant höhere Expression von essentiellen neutrophilen Genen, die an der antibakteriellen Abwehr und NET-Bildung beteiligt sind, wie MPO, NE [31], MMP-9, RNASE2 [ 36] und Peptidyl-Arginin-Deiminase 4 (PADI4) [19] (Abb. 2D–F).Interessanterweise waren CD66b-Transkripte im Einklang mit den höheren CD66b-Spiegeln, die in Huntington-Neutrophilen beobachtet wurden, signifikant erhöht, obwohl sie unter den Expressions-Grenzwerten lagen, verglichen mit HC-Zellen (Zusätzliche Datei 1: Abb. S2C).Darüber hinaus fand eine funktionelle Gensatz-Anreicherungsanalyse auf der HD-hochregulierten Genliste eine signifikante Anreicherung von Genen in mehreren antimikrobiellen Mechanismen und Neutrophilen- oder Leukozyten-Degranulationsanmerkungen (Abb. 2G), während keine signifikante funktionelle Anmerkung auf dem HD-herabregulierten Gensatz identifiziert wurde.Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass eine aberrante Genexpression und unterschiedliche Exozytose verschiedener Körnerpopulationen den chronischen Defekt der Neutrophilenfunktion und ihre verminderte Fähigkeit, NETosis zu induzieren, widerspiegeln könnten [33, 35].Massive neutrophile Degranulation und unzureichende Genexpression von HD-Neutrophilen.Eine Western-Blot-Analyse von Steady-State-Spiegeln der Granula-Proteine ​​MMP-9, MPO und NE aus hochreinen Neutrophilen-Pellets von HC- und HD-Spendern.Gesamtproteine ​​wurden von 3 HC- oder HD-Spendern extrahiert;GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet.B Erhöhte Spiegel der neutrophilen Degranulationsoberflächenmarker CD18, CD11b, CD66b und CD15 bei HD im Vergleich zu HC-Neutrophilen.Überlagerte durchflusszytometrische Histogramm-Plots von einzelnen repräsentativen HC- (blau) und HD-Neutrophilen (rot), die aus Scatter-Plots abgeleitet wurden, die CD66b- oder CD15-Spiegel zeigen (oberes Feld).Mittlere Fluoreszenzintensitäten von CD18, CD11b, CD66b und CD15 bei HD im Vergleich zu HC-Spendern (unteres Feld, n=4).C PCA-Analyse des RNA-Seq-Expressionsprofils von 7 HD- und 7 HC-Patienten.D P-Wert und fold change (log2) Filter für die differenzielle Genexpressionsanalyse von HC Vs.HD-Beispiele.Heraufregulierte Gene der Huntington-Krankheit sind rot markiert, herunterregulierte Gene blau.E Heatmap des ausgewählten Gensets mit Neutrophilenaktivierung und NETosis-bezogener funktioneller Anmerkung, gefunden in HD-Up-Reg.Datensatz.Die Expressionsniveaus sind zwischen 0 und 1 normalisiert. F Normale differentielle Expressionsverteilung auf fünf funktionellen Hauptgenen der NETosis, die eine signifikant höhere Expression in Huntington-Proben im Vergleich zu HC-Spendern zeigt.G Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)-Annotationen und entsprechende p-Werte ergaben, dass der HD-heraufregulierte Gensatz mit Neutrophilen-Aktivierung und Degranulations-bezogenen Genen angereichert istDa die durch PADI4 vermittelte Histon-Hypercitrullinierung und Chromatin-Dekondensation wesentliche erste Schritte der angeborenen antibakteriellen Immunität sind, die durch NETosis vermittelt wird [19], testeten wir die Spiegel des PADI-4-Enzyms, um zu untersuchen, ob seine Gesamtspiegel mit unserer RNA- seq.Die Sondierung der Proteinspiegel von PADI-4 durch WB unter Verwendung von Gesamtzellproteinen von 3 HC- und HD-Spendern zeigte eine bemerkenswerte Verringerung der PADI-4-Steady-State-Spiegel von HD-Zellen ( 3A ).Erneut überraschend zeigten die PADI-4-Proteinspiegel in Huntington-Neutrophilen eine umgekehrte Korrelation zu ihren Transkriptspiegeln.Diese verringerten PADI-4-Proteinspiegel in Huntington-Zellen können die ersten Schritte der NETose (Chromatin-Dekondensation) dysregulieren und zu einer stark beeinträchtigten NETose des NOX-unabhängigen Signalwegs führen.Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir einen mikroskopischen Assay für NETosis etabliert, der mit SYTOX green visualisiert und quantifiziert wurde.Wir haben ein vollautomatisches Bildanalysetool entwickelt, das ein maschinelles Lernmodell verwendet, um den Prozentsatz der NETotischen Zellen unter verschiedenen Behandlungen zu analysieren, um die NET-Bildung mit den mikroskopischen Assays unvoreingenommen zu beurteilen.Die Zellannotation wurde basierend auf der Zellsegmentierung und beschrifteten Bildern durchgeführt, wobei die Zellen in vier Kategorien eingeteilt wurden: lobulierte, delobulierte, diffuse NETs und gespreizte NETs, ​​wie zuvor in [27] durchgeführt.Wir induzierten Zellen von HC- und HD-Spendern mit A23187 und visualisierten NETose mit Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 3B).Uninduzierte Kontrollzellen zeigten keine sichtbaren Unterschiede in der Kernarchitektur oder Kernmorphologie, wenn eine dramatische Verringerung der Ausbreitung von NETs nach 4 h Inkubation mit A23187 möglich war (Abb. 3B).Wir bestätigen diese Ergebnisse weiter, indem wir zellfreie DNA (cfDNA), die durch NETosis freigesetzt wurde, mit einem Sytox-Green-basierten Assay messen, wenn eine geringfügige Erhöhung der cfDNA nach Induktion in HD-Zellen im Vergleich zu HC-Zellen zu sehen war (Abb. 3C).Als nächstes führten wir eine Messung des Kernbereichs und der Morphologie unter Verwendung der vier unterschiedlichen Morphologien während des Fortschreitens zur NET-Bildung (lobulierte, delobulierte, diffuse und gespreizte NETs) [27] (Abb. 3D) mit einem automatisierten Mikroskop-Tool durch.Wir analysierten im Durchschnitt 100 Zellen pro Spender, n = 6 Spender für jede Gruppe;Gemäß unseren früheren Beobachtungen beobachteten wir eine signifikante Verzögerung bei der Ausbreitung von NET-Bildung in Neutrophilen der Huntington-Krankheit und eine Akkumulation von Zellen in delobulierter oder diffuser Kernform (Abb. 3E).Im Gegensatz dazu zeigen nicht induzierte Zellen auch nach 240 min keine offensichtlichen Veränderungen in der Morphologie (Zusatzdatei 1: Abb. S3A).Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse zum ersten Mal, dass Neutrophile von Huntington-Patienten eine verminderte NOX-unabhängige NETose mit einer signifikanten Unterbrechung der Chromatin-Dekondensation aufweisen.Neutrophile von Huntington-Patienten zeigen eine dramatisch verminderte NOX-unabhängige NETose mit einer signifikanten Unterbrechung der Chromatin-Dekondensation.Eine Western-Blot-Analyse von Steady-State-Spiegeln des PADI-4-Enzyms in Neutrophilen von HC- und Huntington-Spendern.B NETosis-Assay und Visualisierung der NET-Entfaltung durch Neutrophile von HC (links) oder HD (rechts), stimuliert mit Calciumionophor A23187 zur Stimulation des NOX-unabhängigen Signalwegs, sichtbar gemacht durch Sytox green in Fluoreszenzmikroskopie.C Quantifizierung der überstehenden cfDNA von Neutrophilen von HC- und HD-Spendern, stimuliert mit A23187 für 3 h.Die verbleibenden Zellen wurden plattiert und die überstehende cfDNA wurde durch einen schnellen fluorometrischen Assay unter Verwendung von Sytox Green quantifiziert.Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SE von RFU n=6 dargestellt.D Das Bildanalysetool für maschinelles Lernen zur Quantifizierung der NETose und der Chromatinarchitektur zeigt beispielhafte Schnappschüsse der vier neutrophilen Kernstadien der NETose als lobulierte, delobulierte, diffuse und gespreizte NETs.E Gesamtbildanalyse von 100 Zellen pro Spender von insgesamt 6 Spendern für jede Gruppe (z. B. HC oder HD).Ohne Stimulation zeigen HC- und HD-Zellen keinen Unterschied in der Verteilung, wenn 85 % der Zellkerne als gelappt definiert sind.Nach 3 h Stimulation mit A23187 wurden 82 % der HC-Zellen als gespreizte NETs in HC definiert, während nur 40 % in HD-Zellen.Wichtig ist, dass in Huntington-Zellen ein großer Teil der Zellen als delobuliert, diffus definiert ist, als Hinweis auf eine Unterbrechung der Chromatin-Dekondensation während der NOX-unabhängigen NET-BildungNeutrophile erzeugen während der Phagozytose ROS und reagieren auf lösliche Agonisten.Diese funktionelle Reaktion, die als oxidativer Ausbruch bezeichnet wird, trägt zur Wirtsabwehr bei [37].Die Unfähigkeit der weißen Blutkörperchen, wirksam auf Infektionen durch Krankheitserreger zu reagieren, wird als Immundysfunktion oder -lähmung definiert.Eine anhaltende Immunparalyse könnte dazu führen, dass Primärinfektionen nicht ausgerottet werden oder die Anfälligkeit für Sekundärinfektionen erhöht wird.Daher haben wir die Raten der ROS-Erzeugung während des oxidativen Ausbruchs im Vergleich zu HC getestet.Durch Live-Cell-Monitoring der ROS-Erzeugung mit spezifischen Indikatoren für H2O2 (grün) oder Superoxid (rot) haben wir die intrazelluläre und extrazelluläre ROS-Produktion auf HC- und HD-Zellen nach Induktion mit PMA und den Endotoxinen LPS gemessen (Zusatzdatei 1: Abb. S3B und S3C).Die Zellen der Huntington-Patienten zeigen eine dramatisch verringerte ROS-Erzeugung, die intrazellulär oder in den extrazellulären Raum für beide Stimuli freigesetzt wird (Abb. 4A, B).Darüber hinaus bestätigte die FACS-Analyse der mittleren Intensitätsniveaus von H2O2 (FITS-Sonde) unsere mikroskopische und biochemische Analyse und zeigte eine Größenordnung in der Produktion von H2O2 in HC-Zellen im Vergleich zu HD (Abb. 4C, oberes Feld).Im Gegensatz dazu zeigten Neutrophile von Huntington-Patienten eine Akkumulation von Superoxid (PE-Sonde) (Abb. 4C, unteres Feld) als Hinweis auf eine Fehlfunktion der ROS-Kaskade.Während ROS eine wichtige Rolle bei der antimikrobiellen Wirtsabwehr und Entzündung spielen, sind sie auch entscheidend für die Signalkaskaden, die zur NET-Freisetzung über NADPH-Oxidase führen [38, 39].Darüber hinaus zeigen Neutrophile von Huntington-Patienten eine wesentliche Verringerung der NE- und MPO-Spiegel, die beide für PMA, Candida albicans und Streptococcus Gruppe B (GBS)-induzierte NETosis erforderlich sind [40];Wir haben dann die Fähigkeit von Huntington-Zellen getestet, NETs im NOX-abhängigen Signalweg zu produzieren.Wie erwartet, beobachteten wir bei der Herausforderung von Neutrophilen von Huntington-Patienten mit Stimuli des NOX-abhängigen Signalwegs wie PMA (Abb. 4D) oder LPS (Abb. 4E) eine dramatische Beeinträchtigung der Bildung von verteilten NETs.Ebenso zeigte die Messung von cfDNA im Überstand von Neutrophilen, die mit PMA induziert wurden, fast fünfmal mehr cfDNA, wenn keine signifikanten Unterschiede in der cfDNA von Huntington-Zellen gefunden wurden ( 4F ).Unsere Ergebnisse legen nahe, dass eine unterschiedliche NOX-Aktivität und eine veränderte oxidative Signalgebung in diesen Zellen wichtige Auswirkungen auf die durch Oxidantien vermittelte angeborene Immunität und Anfälligkeit für Infektionen haben können.Neutrophile, die Huntington-Patienten entnommen wurden, zeigen eine gestörte ROS-Signalgebung und eine beeinträchtigte NOX-abhängige NETose.A Live-Cell-Überwachung der globalen Konzentrationen von ROS/RNS und Superoxid in Neutrophilen, die mit PMA induziert wurden.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarPlus eins.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarArtikel CAS PubMedGoogle ScholarSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen