Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.Der SEA-Komplex (SEAC) ist ein Wachstumsregulator, der als GTPase-aktivierendes Protein (GAP) gegenüber Gtr1 fungiert, einer Rag-GTPase, die den Nährstoffstatus an das Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1) in Hefe1 weiterleitet.Funktionell wurde SEAC in zwei Unterkomplexe unterteilt: SEACIT, das GAP-Aktivität aufweist und TORC1 hemmt, und SEACAT, das SEACIT2 reguliert.Dieses System ist bei Säugetieren konserviert: Der GATOR-Komplex, bestehend aus GATOR1 (SEACIT) und GATOR2 (SEACAT), überträgt Aminosäure3- und Glucose4-Signale an mTORC1.Trotz seiner Bedeutung fehlt die Struktur von SEAC/GATOR und damit das molekulare Verständnis seiner Funktion.Hier lösen wir die Kryo-EM-Struktur des nativen SEAC mit acht Untereinheiten.Der SEAC hat eine modulare Struktur, in der ein SEACAT entsprechender COPII-ähnlicher Käfig zwei flexible Flügel bindet, die SEACIT entsprechen.Die Flügel sind über Sea3, das Teil beider Module ist, mit dem Kern verbunden.Der GAP-Mechanismus von GATOR1 ist in SEACIT konserviert, und die GAP-Aktivität wird durch SEACAT in vitro nicht beeinflusst.In vivo sind die Flügel für die Rekrutierung des SEAC zur Vakuole wesentlich, hauptsächlich über den EGO-Komplex.Unsere Ergebnisse zeigen, dass SEACAT kein direkter Inhibitor von SEACIT ist, sondern als Gerüst für die Bindung von TORC1-Regulatoren fungiert.In der angehenden Hefe Saccharomyces cerevisiae befindet sich das Ziel des Rapamycin-Komplexes 1 (TORC1) auf der Vakuolenmembran und erhält Nährstoffe vom EGO-Komplex (EGOC)5, dem Hefe-Gegenstück des Säugetier-Ragulator-Rag-Komplexes6.Gtr1 und Gtr2, die beiden im EGOC gefundenen GTPasen der Rag-Familie, regulieren die TORC1-Aktivität in Abhängigkeit von ihrem Nukleotid-Beladungsstatus.Gtr1 und Gtr2 werden durch dedizierte GAPs reguliert, den Seh1-assoziierten Komplex (SEAC)1 bzw. Lst4/Lst7 (Lit. 7).Der SEA-Komplex (SEAC) wurde ursprünglich als Coatomer-verwandter Komplex beschrieben8 und später wurde berichtet, dass er funktionell in zwei Unterkomplexe unterteilt ist: SEACIT, der Gtr1-GAP-Aktivität besitzt und somit TORC1 hemmt (Ref. 1), und SEACAT, der angeblich antagonisiert SEACIT und aktiviert somit TORC1 (Ref. 2).Bei Säugetieren ist das SEAC-Gegenstück (GATOR) ebenfalls funktionell in einen GAP-Subkomplex (GATOR1) und seinen Regulator (GATOR2)3 unterteilt.Der SEAC besteht aus acht Untereinheiten8 (GATOR-Untereinheiten in Klammern3): Sea1/Iml1 (DEPDC5), Npr2 (Nprl2) und Npr3 (Nprl3), die den SEACIT (GATOR1)-Unterkomplex bilden, und Sea2 (Wdr24), Sea3 (Wdr59) , Sea4 (Mios), Seh1 (Seh1L) und Sec13 (Sec13), die den Subkomplex SEACAT (GATOR2) bilden.In GATOR1 enthält Nprl2 den katalytischen „Arginin-Finger“ (Nprl2Arg78)9, während diese Funktion in Hefe einem Arginin in Sea1 (Sea1Arg943)1 zugeordnet wurde.Darüber hinaus kann Ragulator-Rag GATOR1 im „inhibitorischen“ und „GAP“-Modus binden10.Derzeit ist unklar, ob der in GATOR1 beobachtete GAP-Mechanismus und die Bindungsmodi in SEACIT konserviert sind.Trotz Berichten, dass Säugetier-Stickstoffsensoren die GATOR1-Aktivität über die Bindung an GATOR2 regulieren (Lit. 11,12,13), ist unbekannt, wie GATOR2 GATOR1 reguliert, und das Fehlen von Strukturen hat ein besseres Verständnis dieser Drehachse der TOR-Signalgebung verhindert.Daher machten wir uns daran, die Struktur des homologen SEAC zu lösen.Der endogene SEAC wurde unter Verwendung eines schonenden Protokolls aus Hefezellen gereinigt, was einen intakten und relativ stabilen Komplex ergab (erweiterte Daten, Abb. 1a).Nach umfassender Optimierung der Proben- und Datensammlung wurde eine kryogene Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Rekonstruktion des SEAC mit einer durchschnittlichen Auflösung von 3,0 Å erreicht (Abb. 1a und Erweiterte Daten Abb. 1b–d).Die Struktur besteht aus einem dimeren zentralen Kern, der als symmetrische Bindungsplattform für zwei identische flexible Flügel dient.Wir haben eine Reihe von Masken und fokussierten Verfeinerungen verwendet, um die Auflösung zu verbessern (erweiterte Daten, Abb. 1 und 2), wodurch Karten mit einer Auflösung von 2,8 Å und 2,7 Å für den Kern bzw. die Flügel erhalten wurden (Abb. 1b).Unter Verwendung von AlphaFold-Strukturvorhersagen14 und Kristallstrukturen von Seh1 und Sec13 haben wir ein Modell des oktameren SEAC (Ergänzungstabelle 1 und erweiterte Daten Abb. 3) erstellt, das mit früheren Vernetzungs- und Proteolysedaten15 übereinstimmt und frühere biochemische Beobachtungen erklärt ( siehe unten).a, Konsens-Kryo-EM-Karte in Vorder-, Seiten- und Rückansicht.b, Fokussierte Karte auf dem Flügelmodul.c, Modell des SEAC mit acht Untereinheiten.d, Domänenorganisation von SEAC-Untereinheiten.N-Term., N-terminal;C-term., C-terminal.Der SEAC bildet eine hohle, C2-symmetrische, käfigartige Struktur mit Abmessungen von ungefähr 251 Å × 302 Å × 240 Å, die 22 Proteinketten mit einer Masse von ungefähr 2 MDa enthält (Abb. 1c).Es gibt zwei Kopien jeder Untereinheit, mit Ausnahme von Sea4 und Seh1, die in vier bzw. sechs Kopien vorhanden sind.Der zentrale Kern enthält Seh1, Sec13, Sea2, Sea4 und Sea3Cter, während die Flügel Sea3Nter, Sea1, Npr2 und Npr3 umfassen (Abb. 1d).In Übereinstimmung mit funktionellen Studien wurden Kernuntereinheiten zuvor SEACAT2 und Flügeluntereinheiten SEACIT1 zugeordnet, mit Ausnahme von Sea3, das zu beiden Einheiten beiträgt.Aufgrund ihrer jeweiligen Positionierung im SEAC bezeichnen wir Sea3Nter als Sea3SIP (SEACIT-Anteil) und Sea3Cter als Sea3SAP (SEACAT-Anteil).Ein flexibler Linker (Sea3-Konnektor), der die Flügel mit dem Kern verbindet, aber in der Dichte nicht sichtbar ist (Abb. 1c), verbindet Sea3SIP und Sea3SAP.Diese Architektur ermöglicht die unabhängige Bewegung der Flügel relativ zum Kern und legt nahe, dass SEACAT und SEACIT in vivo eher zwei Module innerhalb eines einzigen Komplexes darstellen als zwei getrennte Unterkomplexe.Dies erklärt auch, warum der Verlust von Sea3 zur Ablösung von SEACIT von SEACAT15,16 führt.Die drei Hauptkernuntereinheiten Sea2, Sea3 und Sea4 teilen dieselbe Domänenarchitektur (Abb. 1d).Sie bestehen aus einer N-terminalen β-Propellerdomäne, gefolgt von einem kurzen Domäneninvasionsmotiv (DIM)17, einer α-Solenoiddomäne und einer C-terminalen RING-Domäne (Abb. 2a).Diese Domänenanordnung ähnelt der von Coatomer-Proteinen, was darauf hindeutet, dass sich diese Untereinheiten aus einem gemeinsamen Proto-Coatomer-Vorfahren entwickelt haben8,18.Wie erwartet8 zeigen AlphaFold-Vorhersagen für die entsprechenden GATOR2-Untereinheiten eine ähnliche Domänenorganisation (Erweiterte Daten, Abb. 4a,b).Jede dieser Untereinheiten bildet Dimere mit einem der beiden kleinen Coatomer-β-Propeller, die im SEAC vorhanden sind;insbesondere Sea4 und Sea2 mit Seh1 und Sea3 mit Sec13 (Abb. 2a).Die Dimerisierung erfolgt über einen Mechanismus, der dem in der Kernpore17 und COPII19 beobachteten ähnelt, wobei ein DIM eingefügt wird, das ein siebtes Blatt beisteuert und den offenen β-Propeller von Seh1 und Sec13 schließt (Erweiterte Daten, Abb. 4c,d).Dadurch wird die Ausrichtung der N-terminalen β-Propellerdomäne in Bezug auf das α-Solenoid festgelegt, wodurch der Winkel beider Domänen festgelegt wird, um spezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu fördern.Als solche spielen Seh1 und Sec13 (und β-Propellerdomänen im Allgemeinen – es gibt 16 im SEAC) strukturelle Schlüsselrollen, was ihre Bedeutung für die SEACAT-Funktion in vivo2 erklärt.a, Strukturen von Sea4–Seh1, Sea2–Seh1 und Sea3–Sec13.Sowohl Sea2 (links) als auch Sea3 (rechts) interagieren mit Sea4 unter Verwendung der C-terminalen RING-Domäne.b, Vergrößerte Ansicht der RING-RING-Wechselwirkungen zwischen Sea2 und Sea4 (oben) oder Sea3 und Sea4 (unten).c, Struktur des Sea4-Seh1-Kernkäfigs, gebildet aus vier Kopien des Sea4-Seh1-Dimers.Jedes Dimer ist mit I bis IV nummeriert, und Wechselwirkungen zwischen Kopien sind angegeben.d, Protomer-fokussierte Karte, gefärbt gemäß den Untereinheiten, die die Wechselwirkung zwischen Sea2 und Sea3 zeigt, die gegenüberliegende nicht interagierende Kopien von Sea4-Seh1 verbindet.e, Modell des SEAC-Kernprotomers, das die Sea3-Sperre zeigt, eine Erweiterung im Sea3-α-Solenoid, die das Sea2-DIM „sperrt“.Sea2-Seh1- und Sea3-Sec13-Dimere interagieren jeweils mit einer Kopie von Sea4-Seh1 durch Heterodimerisierung ihrer zinkhaltigen RING-Domänen, was erklärt, warum Sea4 im Vergleich zu Sea2 und Sea3 in einem Verhältnis von 2:1 vorhanden ist (Abb. 2b).Die Strukturen der Sea2- und Sea4-RING-Domänen sind im Vergleich zum Sea3-RING ähnlicher (erweiterte Daten, Fig. 5a).Die RING-Heterodimere landen zwischen zwei Coatomer-β-Propellern, Seh1–Seh1 (Sea2- und Sea4-RINGe) und Seh1–Sec13 (Sea3- und Sea4-RINGe).Diese Architektur erklärt, warum das Entfernen der RING-Domäne von Sea2, Sea3 oder Sea4 zu einer komplexen Dissoziation führt15.RING-Domänen wurden typischerweise mit E3-Ubiquitin-Ligasen assoziiert20 und die RWD-Domäne, die in Sea3SIP vorhanden ist, ist strukturell verwandt mit E2-konjugierenden Enzymen21.Im SEAC spielen sie eindeutig eine strukturelle Rolle – eine Ubiquitin-bezogene Funktion muss noch bestimmt werden.Der zentrale Käfig des Kerns wird von einem Heterotetramer von Sea4-Seh1-Dimeren (I bis IV) (Abb. 2c) gebildet, analog zum COPII-Käfig, wo der minimale Käfig von einem Heterotetramer von Sec31-Sec13-Dimeren gebildet wird22 (Erweiterte Daten Fig. 5b).Der Sea4-Seh1-Käfig bildet über zwei Schnittstellen im Sea4-β-Propeller eine Lemniskatenform: Kopie I und IV bilden vorne eine flexible Interaktion, während II und III die Rückseite des Käfigs schließen und mit den Flügeln interagieren (siehe unten) .Benachbarte Kopien von Sea4 homodimerisieren über ihre α-Solenoiddomäne, die sich zu einem „Vorfahren-Coatomer-Element 1“ (ACE1) (erweiterte Daten, Abb. 5c) faltet, einem J-förmigen Strukturmotiv, das in Proteinen aus den Kernporen- und Vesikelhüllen23 beobachtet wird wurde gezeigt, dass es die Homo- oder Heterodimerisierung vermittelt24.Der Sea4-Seh1-Käfig wird durch Wechselwirkungen zwischen Sea2 und Sea3 stabilisiert, die ihre α-Solenoiddomänen gegeneinander packen und nicht interagierende Sea4-Seh1-Kopien (I–III und II–IV) verbinden (Abb. 2d).Darüber hinaus umschließt eine Erweiterung in der α-Solenoid-Domäne von Sea3 (Sea3-Sperre) Sea2, fügt ein β-Faltblatt zu Seh1 hinzu und "verriegelt" das Sea2-DIM an Ort und Stelle (Abb. 2e).Insgesamt zeigt dieser komplizierte Satz von Wechselwirkungen, dass alle Kernuntereinheiten erforderlich sind, um einen stabilen, funktionellen Komplex zu bilden.Der größte Teil der Masse des SEAC-Flügels wird von den SEACIT-Untereinheiten Sea1, Npr2 und Npr3 gebildet, die ähnliche Interaktionsschnittstellen wie GATOR1 (Ref. 25) verwenden (Abb. 3a und Erweiterte Daten Abb. 6a).Npr2 und Npr3 bestehen aus einem N-terminalen Lappen (N-Lobe) und einem C-terminalen Lappen (C-Lobe), die miteinander interagieren und über einen Linker verbunden sind (Extended Data Abb. 6b).Die N-Lappen enthalten die Longin-Domänen und sind weit vom SEAC-Kern entfernt, während das C-Lappen-Heterodimer der Sea4-β-Propeller-Domäne (II oder III) zugewandt ist (Abb. 3b).Wie unten detailliert beschrieben, enthält der Npr2N-Lappen auch das katalytische Arginin (Npr2Arg84) (Abb. 3a).a,b, Struktur des SEAC-Flügels (a) und um 180° gedreht (b).Kernelemente an der Schnittstelle werden ebenfalls gezeigt.Die Positionen der beiden funktionell wichtigen Argininreste sind angegeben.c–e, Wechselwirkungen zwischen Sea3SIP und Sea1–Npr2 (c), mit um 80° gedrehter Ansicht (d) und Npr2–Npr3 (e).Reste in Sea3, Sea4, Npr2, Npr3 oder Sea1, die in ihren GATOR-Gegenstücken konserviert sind, sind mit einem Sternchen gekennzeichnet, chemisch ähnliche Aminosäuren sind mit zwei Sternchen und reziproke Ladungsumkehr mit einem Hashtag (im Fall von Npr2E213) gekennzeichnet.Sea1 ist am Rand des Flügels positioniert und verwendet seine SABA-Domäne, um mit Npr2 zu interagieren (erweiterte Daten, Abb. 6c), während die C-terminale Region (Sea1Cter), die das SHEN, das DEP (das nicht aufgelöst wird) und die CTD, ist flexibler und interagiert nicht mit dem Rest des Flügels (Abb. 3b und Erweiterte Daten Abb. 6a).Wir konnten eine Erweiterung im Sea1SABA auflösen, die teilweise geordnet wird und sich zwischen den Sea3SIP-β-Propeller und den Npr2C-Lappen einfügt, mit letzterem interagiert und ihn umhüllt (Abb. 3b und Erweiterte Daten Abb. 6d).Die Wechselwirkung zwischen Sea1 und Npr2 scheint durch das Sea3SIP stabilisiert zu werden, da sein β-Propeller auf der Sea1SABA-Npr2N-Lappenverbindung positioniert ist und eine dreiteilige Sea1-Npr2-Sea3-Wechselwirkung bildet (Abb. 3c, d).In Übereinstimmung mit der Rolle von Sea3SIP bei der Stabilisierung des Flügels führte die Deletion von SEA3SAP dazu, dass die Zellen ähnlich wie bei anderen SEACAT-Mutanten überempfindlich gegen Rapamycin wurden, während die Deletion von SEA3 einen Phänotyp verursachte, der zwischen SEACAT- und SEACIT-Mutanten liegt (Erweiterte Daten Fig. 6e,f ).Darüber hinaus konnte in Abwesenheit von Sea3SIP die Reinigung von SEACIT keinen stabilen Komplex ergeben (Daten nicht gezeigt).Daher hat Sea3 sowohl in SEACIT (über das SIP) als auch in SEACAT (über das SAP) eine doppelte Rolle.Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Beobachtungen bei Schizosaccharomyces pombe überein und erklären diese, wo Sea3 Teil des SEACIT16 ist, und bei Säugetieren, wo gezeigt wurde, dass Wdr59 eine hemmende Rolle spielt, die für eine ordnungsgemäße mTORC1-Hemmung nach Nährstoffentzug erforderlich ist26.Der Npr3C-Flügel spielt eine wichtige Rolle bei der Organisation des Flügels relativ zum Kern, da er zusätzlich zum Kontakt mit dem Npr2C-Flügel zwischen dem Sea4-β-Propeller und dem Sea3-RWD eingeklemmt ist (Abb. 3b).Der Npr3C-Lappen macht die einzige sichtbare Wechselwirkung zwischen dem Flügel und dem Kern, indem er eine negativ geladene Schleife in eine positiv geladene Tasche im Sea4-β-Propeller einfügt (Abb. 3e und Erweiterte Daten Abb. 7a, b).Diese Interaktion scheint auch durch das Sea3SIP über eine Schleife (N-Schleife) stabilisiert zu werden, die seinen β-Propeller und RWD verbindet, die oben auf der Npr3C-Keule-Npr2C-Keule-Schnittstelle eingefügt wird (Abb. 3e und Erweiterte Daten Abb. 7c,d).Die Position und Wechselwirkungen von Npr3 im Flügel erklären, warum die Deletion von NPR3 (Ref. 15) oder NPRL3 (Ref. 25) SEACIT/GATOR1 von SEACAT/GATOR2 dissoziiert (erweiterte Daten, Fig. 7e).Wir stellen fest, dass, obwohl mehrere Sea3-Reste, die für Wechselwirkungen mit Npr2, Npr3 und Sea1 wichtig sind, in Wdr59 konserviert sind, die entsprechende Aminosäurekonservierung in den Nprl2-, Nprl3- und DEPDC5-Partnern im Wesentlichen fehlt (Abb. 3c – e).Dies erklärt möglicherweise die stabilere Assoziation zwischen SEACAT und SEACIT im SEAC im Vergleich zu GATOR1 und GATOR2 in GATOR sowie die Notwendigkeit von KICSTOR, GATOR in Säugetieren zu stabilisieren26,27.Npr2Arg84, der GATOR1-äquivalente katalytische Rest, der sich im Npr2N-Lappen befindet, ist für Lösungsmittel zugänglich und gegenüber der Kern-Flügel-Grenzfläche positioniert, weit entfernt von jedem Element des Kerns oder des Sea3SIP (Abb. 3a).Der Vergleich von GATOR1-Ragulator-Rag in seiner aktiven Konformation10 mit der Struktur des Flügels zeigt, dass Npr2Arg84 für die Katalyse bereit ist (Abb. 4a).Ein ebenfalls konserviertes Arginin in Sea1 (Sea1Arg943) wurde zuvor als katalytischer Rest vorgeschlagen1.Dieser Rest befindet sich jedoch in einer Helix, die im Sea1SHEN vergraben ist, und nimmt daher wahrscheinlich nicht an der Katalyse teil (erweiterte Daten, Abb. 8a).a, Struktur des SEAC-aktiven Zentrums, überlagert auf die Struktur der aktiven GATOR1-Ragulator-Rag-Struktur.b, Repräsentative Dünnschichtchromatographie von In-vitro-GAP-Assays (n = 2–3 unabhängige Experimente).c, Relative Fold Change der GAP-Aktivität zwischen Wildtyp-SEAC, Sea1R943A, Npr2R84A und isoliertem SEAC-Flügel.Der Vergleich zwischen vollständigem Komplex und Flügel wurde mit Protein durchgeführt, das aus Sea1-TAP-Stämmen gereinigt wurde.Unabhängige Datenpunkte werden gegebenenfalls als Mittelwerte ± SD dargestellt (n = 2 für Sea4-TAP-Stämme und n = 3 für Sea1-TAP-Stämme).d, Wachstumsassays auf Prolin, wobei GAP-defekte Mutanten einen langsam wachsenden Phänotyp aufweisen.e, SEAC-Lokalisierung, verfolgt durch Visualisierung von endogen markiertem Sea4-GFP, in Wildtyp- (WT), ∆Sea3-, ∆Sea3SAP- und ∆Sea1-Hintergründen.f, SEAC-Lokalisierung in ∆Sea1Cter- und ∆Sea1CS-Stämmen.g, Wachstumsassays auf Prolin für Sea1-Mutantenstämme.h, Rapamycin-Wachstumsassays, die zeigen, dass SEA1-Mutationen epistatisch zu SEA3-Mutationen sind.i, SEAC-Lokalisierung im ∆Gtr1∆Gtr2-Stamm.j, Quantifizierung des Vakuolen-zu-Cytosol-Verhältnisses (Mittelwert ± Standardabweichung) des Sea4-GFP-Signals in Zellen von e, f und i (n = 30 Zellen pro Stamm).k, Modell des an das EGOC gebundenen SEAC in der Vakuolenmembran.Als alternativer Anker wird ein unbekanntes Protein gezeigt, das möglicherweise mit dem Sea1Cter interagiert.Maßstabsbalken, 10 μm.Unsere Struktur sagt somit voraus, dass, wie in GATOR1, eher Npr2Arg84 als Sea1Arg943 das katalytische Arginin ist und dass das SEAC in einer aktiven Konformation vorliegt (d. h. die Bindung von SEACAT an SEACIT reicht nicht aus, um seine GAP-Aktivität zu hemmen).Um diese Vorhersagen zu testen, etablierten wir In-vitro-GAP-Assays unter Verwendung unserer nativen SEAC-Reinigungen in Kombination mit rekombinant exprimiertem EGOC.In Übereinstimmung mit unserer Struktur war der SEAC in der Lage, die GTP-Hydrolyse durch Gtr1 ähnlich wie bei einem isolierten Flügel (der das Sea3SIP enthält) (Abb. 4b, c) robust zu stimulieren, was bestätigt, dass die EGOC-Bindung im Kontext des SEAC untergebracht ist.Um zu bestimmen, welches Arginin für die Katalyse verantwortlich ist, haben wir native SEAC-Varianten gereinigt, die eine Alanin-Substitution in entweder Npr2Arg84 oder Sea1Arg943 enthalten, und sie in vitro auf GAP-Aktivität getestet.Unerwarteterweise waren beide Mutanten defekt (Abb. 4b, c).Wir stellten fest, dass gereinigtes SEACSea1R943A ein deutliches Bandenmuster durch SDS-PAGE zeigte, wobei die obere Bande, die Sea1 entsprach, fehlte (erweiterte Daten, Abb. 8b).Daher haben wir diese mutierten Komplexe durch Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung weiter charakterisiert.Während zweidimensionale (2D) Klassendurchschnitte von SEACNpr2R84A einen intakten SEAC ähnlich dem Wildtyp zeigten, zeigten 2D-Klassendurchschnitte von SEACSea1R943A das Vorhandensein abnormaler Komplexe, denen der Flügel fehlt (erweiterte Daten, Fig. 8c).Da Sea1Arg943 anscheinend an Wechselwirkungen mit benachbarten Resten teilnimmt (erweiterte Daten, Abb. 8a), nehmen wir an, dass diese Mutation die Struktur von Sea1 destabilisiert, was wiederum die Struktur des Flügels destabilisiert, was zu einer verringerten GAP-Aktivität führt.In Übereinstimmung damit, dass die SEAC-GAP-Aktivität in vivo wichtig ist, beobachteten wir funktionelle Defekte für die Npr2R84A-Mutation, aber überraschenderweise nicht für Sea1R943A (Abb. 4d).Dies deutet darauf hin, dass die Sea1R943A-Mutation den Komplex während der Reinigung destabilisiert, aber eine ausreichende GAP-Aktivität in vivo beibehält.In COPII wird die Sec31-Sec13-Hülle über eine Wechselwirkung zwischen einer flexiblen Region in Sec31 (Lit. 28) und dem aus Sec23-Sec24 bestehenden Adapterkomplex, der selbst membrangebundenes Sar1-GTP29 bindet, an die Membran rekrutiert.Wie Npr2 ist auch Sec23 ein GAP, das einen Arginin-Finger28 verwendet, um die GTPase-Aktivität von Sar1 zu stimulieren.Angesichts der architektonischen Ähnlichkeiten zwischen den COPII- und SEAC-Käfigen schlossen wir, dass ein ähnlicher Mechanismus im SEAC auftreten könnte, wobei der Flügel den Kern über membrangebundenes EGOC zur Vakuolenmembran rekrutiert.Zu diesem Zweck verwendeten wir einen endogenen GFP-Tag in SEA4, um die Lokalisierung des SEAC in vivo zu verfolgen.In Wildtypzellen beobachteten wir ein starkes vakuoläres Signal, das bei Entfernung von Sea3, Sea3SAP oder Sea1 verloren ging (Abb. 4e).Dies deutet darauf hin, dass der SEAC über die SEACIT-Flügel an die Vakuole gebunden ist.Wir haben getestet, ob der Sea1Cter, der flexibler als der Rest des Flügels ist und keine sichtbaren Wechselwirkungen mit ihm hat (erweiterte Daten, Abb. 8d), speziell an der vakuolären Rekrutierung beteiligt ist.Die Deletion des SEA1Cter verringerte nicht nur die vakuoläre Lokalisierung (Abb. 4f), sondern verursachte auch einen Phänotyp der SEACIT-Mutante, vergleichbar mit der vollständigen Deletion von SEA1 (Abb. 4g).Interessanterweise war die Deletion des SEA1Cter epistatisch zur Deletion des SEA3SAP, was hervorhebt, dass der Sea1Cter in vivo eine wichtige Rolle spielt (Abb. 4h).Im „inhibitorischen Modus“ bindet Ragulator-Rag an GATOR1 über das DEPDC5SHEN (Ref. 25).Trotz geringer Sequenzerhaltung ähnelt die Struktur von Sea1SHEN der von DEPDC5SHEN (erweiterte Daten, Fig. 8e).Da das Sea1SHEN Teil des Sea1Cter ist, haben wir getestet, ob das Sea1SHEN für den im ∆Sea1Cter-Stamm beobachteten Phänotyp verantwortlich ist, indem wir den sogenannten „kritischen Streifen“ (CS; Extended Data Abb. 8f) entfernt haben, der in GATOR1 die Bindung vermittelt zu RagA im „inhibitorischen Modus“25.Wir haben weder Lokalisierungs- noch Funktionsdefekte für diese Mutante beobachtet (Abb. 4f, g), was darauf hindeutet, dass der „Hemmmodus“ in Hefe nicht konserviert ist, wie zuvor vorgeschlagen9.Die obigen Ergebnisse zeigten, dass der SEAC über eine Interaktion mit dem EGOC im "GAP-Modus" zur Vakuole rekrutiert wird.Um diese Hypothese zu testen, haben wir festgestellt, ob die Deletion von GTR1 und GTR2, die die Wechselwirkung mit dem EGOC beseitigen sollte, die SEAC-Lokalisierung beeinflusst.Seltsamerweise reduzierte das Löschen von GTR1 und GTR2 die vakuoläre SEAC-Lokalisation nicht in demselben Maße wie das Löschen von Sea1 und Sea3 (Abb. 4i, j), was darauf hindeutet, dass ein zusätzlicher EGOC-unabhängiger Mechanismus für die vakuoläre Rekrutierung existiert.Um die Regulation des SEAC besser zu verstehen, haben wir unsere strukturellen und funktionellen Daten verwendet, um den SEAC-EGOC-Superkomplex auf der Vakuolenmembran zu modellieren (Abb. 4k und Erweiterte Daten Abb. 9a – d).Da der Komplex aktiv ist, modellierten wir die EGOC-Bindung an den SEAC-Flügel im „GAP-Modus“ auf der Grundlage der GATOR1-Ragulator-Rag-Struktur10 und unter Berücksichtigung der räumlichen Beschränkung durch den flexiblen N-terminalen Schwanz von Ego1.Erfreulicherweise ist die Bindung von EGOC in jedem Flügel gut untergebracht, da die letzte geordnete N-terminale Helix von Ego1 zur Vakuolenmembran zeigt.Dieser Schwanz kann sich bis zu etwa 150 Å erstrecken, was ausreichend Platz schafft, um das Zusammenstoßen des distalen Endes des Flügels mit der Membran zu verhindern.Darüber hinaus ist der flexible Sea1Cter der Membran zugewandt positioniert, während der Kern parallel zur Membran endet und dem Zytosol zugewandt ist, wodurch er für die Bindung von nährstoffabhängigen Regulatoren zugänglich wird.In dieser Konfiguration könnten die Flügel aufgrund ihrer Flexibilität unterschiedliche Membrankrümmungen aufnehmen.Auf der Grundlage unserer Daten und aktueller Literatur schlagen wir vor, dass der SEAC-Kern (dh SEACAT) als Gerüstkomplex fungiert, der erforderlich, aber nicht ausreichend ist, um die Aktivität der Flügel zu regulieren.Angesichts der Ergebnisse unserer In-vitro-GAP-Assays erscheint eine direkte Hemmung durch den Kern tatsächlich unwahrscheinlich.Sowohl Sestrin2 (Ref. 30) als auch CASTOR1 (Ref. 31) binden an Wdr24 (Sea2) und Seh1L (Seh1), die in unserer Struktur eine Schnittstelle neben den Flügeln bilden und eine konservierte Struktur haben (Abb. 4k und Extended Data Abb 10a,b).Wie im Säugersystem können Hefe-Nährstoffsensoren an den Kern binden, um die GAP-Aktivität der Flügel zu regulieren (benötigen aber wahrscheinlich zusätzliche Faktoren bei dieser Regulierung).Insgesamt weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass der SEAC-Kern (SEACAT/GATOR2) eher als passiver als als aktiver Regulator der Flügel (SEACIT/GATOR1) fungiert.Während der Überarbeitung dieses Manuskripts wurde die Kryo-EM-Struktur des menschlichen GATOR2-Komplexes veröffentlicht32.GATOR2 hat eine praktisch identische Struktur wie der SEAC-Kern (SEACAT) (erweiterte Daten, Abb. 10c), und die Daten stimmen mit unserer Studie überein, was weiter unterstreicht, dass der molekulare Wirkungsmechanismus von SEAC und GATOR konserviert ist.Die Modellierung eines vorläufigen GATOR-Holokomplexes zeigt, dass GATOR2 die Position von GATOR1 relativ zur Membran einschränken würde, aber die Bindung von Ragulator-Rag im „inhibitorischen“ und „GAP“-Modus ermöglichen würde, möglicherweise gleichzeitig (erweiterte Daten, Abb. 10d).Daher reguliert GATOR2 GATOR1 möglicherweise nicht durch Umwandlung zwischen diesen beiden Bindungsmodi, wie zuvor vorgeschlagen10.Hefestämme wurden unter Verwendung klassischer rekombinationsbasierter Techniken konstruiert.Der ∆Sea1CS-Stamm wurde unter Verwendung von CRISPR-basierter Mutagenese erzeugt.Die in dieser Studie verwendeten Stämme sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Plasmide sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Alle Stämme wurden durch PCR und/oder Sequenzierung verifiziert.Zellen, die Sea4-TAP exprimieren, wurden bis zu einer optischen Dichte (OD600) von 4–6 gezüchtet, durch 10-minütige Zentrifugation bei 6.000 U/min gesammelt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.Die Zellen wurden lysiert und in 3–5 Volumina Lysepuffer resuspendiert (SEAC-Puffer: 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 300 mM NaCl, 5 mM CHAPS, 10 % Glycerin, 2 mM DTT; plus 1 mM PMSF und 1 × Complete Protease-Inhibitor-Tabletten (Roche)).Alle Schritte wurden bei 4 °C durchgeführt.Das Lysat wurde durch Zentrifugation bei 16.000 U/min (30.600 g) für 1 h geklärt, und der Überstand wurde mit IgG-gekoppelten Dynabeads M270 (ThermoFisher Scientific) für 2 h inkubiert.SEAC-gebundene Kügelchen wurden ausgiebig mit Lyse und SEAC-Puffer gewaschen und dann über Nacht mit TEV-Protease (0,1 mg ml –1) in Elutionspuffer (20 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 300 mM NaCl, 2 mM DTT) inkubiert.Das Eluat wurde durch Zentrifugation bei 13.000 g für 5 min geklärt und sofort für die Cryo-EM-Grid-Präparation verwendet.Ein Plasmid, das Gtr1 (WT oder Q65L) und Gtr2 ohne Affinitäts-Tag enthielt, wurde in Escherichia coli BL21* mit einem Plasmid, das Codon-optimierte Sequenzen für 6×HIS-Ego1 (∆1–37), Ego2 (∆1–7) enthielt, cotransformiert. und Ego3.Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 0,1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid bei 18°C ​​über Nacht induziert.Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 300 mM NaCl, 5 % Glycerin, 20 mM Imidazol, 0,15 % CHAPS, 1 mM MgCl2, 1 μg ml−1 DNase, 1 μg) resuspendiert ml−1 Lysozym), ergänzt mit 1 mM PMSF und komplettem EDTA-freiem Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche).Die Zellen wurden unter Verwendung eines Emulsiflex-Systems (Avestin) lysiert und durch 45-minütige Zentrifugation bei 15.000 U/min bei 4°C geklärt.Die lösliche Fraktion wurde einer Affinitätsreinigung unter Verwendung einer chelatbildenden HiTrap FF-Rohsäule (GE Healthcare) unterzogen.Nach dem Waschen wurde das Protein unter Verwendung von 250 mM Imidazol eluiert.Fraktionen, die den Komplex enthielten, wurden gepoolt und mit einer HiPrep 26/10-Säule auf 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 2 mM DTT pufferausgetauscht.Die Probe wurde dann auf eine MonoQ FF-Säule (GE Healthcare) aufgetragen und mit einem Gradienten von 150 mM bis 1 M NaCl eluiert.Fraktionen, die den Komplex enthielten, wurden über Nacht mit 20 mM EDTA bei 4 °C inkubiert, auf 10 mg ml–1 konzentriert (unter Verwendung eines 100-kDa-Amicon-Filters) und auf eine Superdex GF200-Erhöhung (GE Healthcare) geladen, die mit 25 mM HEPES, pH 7,4, äquilibriert war. 150 mM NaCl, 10 % Glycerol, 2 mM DTT, 2 mM EDTA.Die reinsten Fraktionen wurden gesammelt und auf 5–10 mg ml−1 konzentriert.Aliquots wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.200 nM EGOC (WT oder Gtr1Q65L) wurden mit 40 nM [α−32P]GTP in Ladepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM MgCl2, 2 mM DTT) für 30 min bei Raumtemperatur beladen.Die Reaktion wurde durch Mischen von 1 μl Wildtyp, Variante SEAC oder Wing, 4 μl beladenem EGOC, 1 μl 10X GAP-Puffer (200 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM MgCl2, 20 mM DTT, 20 mM GTP) und 4 gestartet ul SEAC-Puffer, für ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 ul, und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 &mgr;l STOP-Puffer (1 % SDS, 25 mM EDTA, 5 mM GTP und 5 mM GDP) und Erhitzen für 4 Minuten bei 65°C gestoppt.Die Reaktion (2–4 μl) wurde auf PEI-Cellulose-F-Platten (Merck) getüpfelt und durch Dünnschichtchromatographie in 1 M Essigsäure und 0,8 M LiCl aufgetrennt.Nach dem Trocknen wurde die Platte über Nacht einem Leuchtstoffschirm ausgesetzt und in einem GE Typhoon-Phosphor-Imager bebildert.Die Quantifizierung wurde in ImageJ 1.52p durchgeführt.Die Daten wurden in GraphPad Prism 8 visualisiert und geplottet.Die angegebenen Stämme wurden über Nacht in vollständigem synthetischem Medium (CSM; 2 % Glucose, Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren mit Ammoniumsulfat und Drop-out-Mischung) gezüchtet.Vor den Experimenten wurden die Stämme verdünnt und dann auf eine OD600 von etwa 0,1 gezüchtet.Jeder Stamm wurde auf CSM-Platten getüpfelt, die 0 oder 5 nM Rapamycin enthielten, und vor der Abbildung 2 Tage lang bei 30 °C inkubiert.Alle Spot-Assays wurden mindestens dreimal für jeden Stamm durchgeführt.Wir beobachteten nur einen schwachen Phänotyp für SEACIT-Mutanten, wenn sie auf Rapamycin gezüchtet wurden (leichte Erhöhung der Rapamycin-Resistenz).Da SEAC Stickstoff in Hefe signalisiert, untersuchten wir SEACIT-Mutanten auf Wachstum auf Prolin, einer schlechten Stickstoffquelle.Dies ergab einen stärkeren Phänotyp und wurde daher zur Charakterisierung von SEACIT-Mutanten verwendet.Für das Wachstum auf Prolinplatten wurden Stämme durch Transformation mit dem pJU450-Plasmid33 (enthaltend TRP1, HIS3 und LEU2) prototroph gemacht.Die Stämme wurden in Prolinmedien auf eine OD600 von etwa 0,1 verdünnt und auf CSM (-Trp, -His, -Leu)-Platten (plus oder minus Prolin) getupft und vor der Bildgebung 1–2 Tage bei 30 °C inkubiert.Alle Spot-Assays wurden mindestens dreimal für jeden Stamm durchgeführt.Stämme wurden über Nacht in CSM vorkultiviert.Vor der Bildgebung wurden die Stämme auf eine OD600 von etwa 0,2–0,4 verdünnt und bei einer OD600 von etwa 0,7–1 abgebildet.Stapel von Bildern (mindestens drei pro Stamm) wurden auf einem Zeiss LSM800 konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop gesammelt und mit ImageJ 1.52p verarbeitet.Zum Vergleich zwischen Stämmen wurden Z-Stapel von ungefähr 2 μm unter Verwendung einer maximalen Projektion gemittelt.Zur Quantifizierung des GFP-Signals auf der Vakuole wurden Zellen bis zur späten exponentiellen Phase in CSM (OD600 ungefähr 0,8–1) gezüchtet und mit 5 μM FM 4-64 (ThermoFisher) für 30–40 min bei 30 °C inkubiert.Das Verhältnis des mittleren GFP-Signals in der Vakuole gegenüber dem Zytosol wurde in ImageJ 1.52p wie folgt berechnet.Zuerst wurde ein maximales Projektionsbild für den Kanal FM 4-64 verwendet, um die Vakuole mit dem elliptischen Werkzeug (Vakuolenregion von Interesse, vROI) abzugrenzen.Dann wurden vROI auf den summierten Stapel-DIC-Kanal gelegt, um manuell einen ROI im Zytosol (cROI) von Zellen mit vROI mit dem Freihandwerkzeug zu verfolgen, wobei sorgfältig versucht wurde, kein Signal von der Vakuole einzubeziehen.Nur Zellen mit einer deutlich gefärbten Vakuole und ausreichender zytosolischer Fläche wurden in die Analyse eingeschlossen (n = 30 Zellen pro Stamm).Das Verhältnis von Vakuolen- zu Cytosol-GFP-Intensität wurde dann berechnet, indem die mittlere Intensität in jedem ROI auf dem maximalen Projektionsbild des GFP-Kanals gemessen und die mittlere GFP-Intensität im vROI durch die mittlere GFP-Intensität im cROI dividiert wurde.Dieses Protokoll gewährleistet eine unvoreingenommene Art der Quantifizierung, da der GFP-Kanal nicht für eine ROI-Bestimmung verwendet wird.Die Daten wurden in GraphPad Prism 8 visualisiert und geplottet.Eine 5-μl-Probe von frisch gereinigtem SEAC wurde auf QuantiFoil Au 1.2/1.3-Gitter aufgetragen, die zuvor mit einer dünnen Schicht Graphenoxid beschichtet waren, und unter Verwendung eines Leica GP2-Systems bei 10 °C und 90 % Luftfeuchtigkeit tauchgefroren.Gitter mit negativer Färbung wurden hergestellt, indem 6 &mgr;l der Probe direkt auf Carbon Square Mesh, Cu, 300 Mesh, UL-Gitter (Electron Microscopy Sciences) aufgetragen und 3 Minuten lang inkubiert wurden.Überschüssige Probe wurde mit Filterpapier entfernt, und die Gitter wurden mit 1 % Uranylacetat gefärbt, gefolgt von der Entfernung des überschüssigen Flecks mit Filterpapier und Trocknen.Kryo-EM-Daten wurden mit EPU v.2.14 in einem 300-kV-Titan Krios, ausgestattet mit einem Falcon 4-Direktelektronendetektor und Selectris X-Energiefilter (ThermoFisher) (DCI Lausanne), erfasst.Filme wurden im EER-Modus mit einer Gesamtdosis von 40 e/Å2 und einem Zieldefokussierungsbereich von –1,6 bis –0,6 μm, einer Spaltbreite von 10 eV und einer Pixelgröße von 0,726 Å (165.000-fache Vergrößerung) aufgenommen.Insgesamt 15.922 Filme (in zwei Sitzungen mit 11.174 und 4.748 Filmen) wurden ungekippt gesammelt, und 3.182 Filme wurden mit einer Neigung von 35° unter Verwendung ähnlicher Mikroskopeinstellungen gesammelt.Negativfärbungsdaten wurden mit EPU v.2.14 in einem 120-kV-Talos L120C, ausgestattet mit einer CETA-Kamera (ThermoFisher) (DCI Genf), erfasst.Bilder wurden mit einer nominellen Pixelgröße von 1,927 Å aufgenommen.Insgesamt wurden 334 Bilder für Wildtyp-SEAC, 333 Bilder für SEACNpr2R84A und 301 Bilder für SEACSea1R943A aufgenommen.Die gesamte Verarbeitung wurde in CryoSPARC v.3.2.234 (Ref. 34) durchgeführt.Wissenschaft.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarNat.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMol.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMol.Zelle.PubMed PubMed Central Google ScholarChem.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarMol.ADS CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMedGoogle ScholarMol.Zelle.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarPubMed PubMed Central Google ScholarWissenschaft.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMedGoogle ScholarADS CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMedGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarCAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarADS CAS PubMedGoogle ScholarMol.Nat.Nat.biol.Kommun.biol.PubMed PubMed Central Google ScholarJ.Mol.biol.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarChem.Mol.Wissenschaft.Erw.ADS CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarChem.CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed 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