Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 17785 (2022 ) Diesen Artikel zitierenStreptomyceten sind allgegenwärtige Bodenbakterien.Hier berichten wir über die vollständige und kommentierte Genomsequenz und Charakterisierung des Streptomyces-Phagen Pablito, isoliert aus einer Bodenprobe in Haarlem, Niederlande, unter Verwendung von Streptomyces lividans als Wirt.Dieser Phage war in der Lage, eine Vielzahl von Streptomyces-Stämmen zu infizieren, aber keinen, der zur Schwestergattung Kitasatospora gehörte.Phage Pablito hat doppelsträngige DNA mit einer Genomlänge von 49.581 Basenpaaren, die 76 mutmaßliche Proteine ​​kodiert, von denen 26 vorhergesagt werden konnten.Das Vorhandensein eines Serin-Integrase-Proteins zeigte die lysogene Natur des Phagen Pablito an.Der Phage blieb über einen weiten Temperaturbereich (25–45 °C) und bei pH ≥ 7,0 stabil, verlor jedoch bei Temperaturen über 55 °C oder wenn der pH-Wert unter 6,0 fiel, seine Infektiosität.Dieser neu isolierte Phage ist eng mit dem Streptomyces-Phagen Janus und Hank144 verwandt und wird als neue Spezies angesehen, die in die Gattung Janusvirus innerhalb der Unterfamilie Arquattrovirinae eingeordnet wird.Streptomyces spp.sind grampositive, sporenbildende Bakterien, die in fast allen Bodenmilieus gedeihen.Sie sind bekannt für ihre Fähigkeit, eine breite Palette klinisch relevanter Antibiotika wie Streptomycin, Neomycin, Chloramphenicol und viele mehr herzustellen1,2,3.Die meisten Forschungsarbeiten konzentrierten sich auf die industrielle Verwendung dieser Bakterien und ihre Sekretion von sekundären Metaboliten4,5.Es ist jedoch noch weitgehend unbekannt, wie Bakteriophagen diese vielzelligen Bakterien erkennen, anheften und infizieren können.Streptomyces haben einen ungewöhnlichen Lebenszyklus, der beginnt, wenn Sporen auf eine günstige Umgebung treffen.Dies löst die Keimung und das Auswachsen in ein sogenanntes vegetatives Myzel aus.Nach einer Phase des vegetativen Wachstums werden Lufthyphen gebildet, die sich zu Sporenketten entwickeln können.Diese Sporen können in günstigere Umgebungen verteilt werden, um neue Kolonien zu gründen.Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Streptomyces-Phagen nur junge vegetative Mycelien, aber keine Sporen infizieren können6,7.Die meiste Bakteriophagenforschung konzentrierte sich jedoch auf einzellige Bakterien, während die Wechselwirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen von Bakteriophagen, die vielzellige Bakterien wie Streptomyces infizieren, weitgehend unerforscht bleiben.Neben dem System zur Begrenzung des Phagenwachstums8,9, der chemischen Abwehr10 und dem kürzlich entdeckten Zellwandmangel11 könnten viele weitere Abwehrmechanismen gegen Phagenangriffe in Streptomyces vorhanden sein.Außerdem wurden im Vergleich zu anderen Gattungen relativ wenige Streptomyces-Phagen richtig sequenziert und charakterisiert.Daher ist es wichtig, neue Phagen zu isolieren, die vielzellige Bakterienarten infizieren, um unser Wissen über die immense virale Vielfalt zu erweitern.In diesem Artikel beschreiben wir einen neu entdeckten Actinobacteriophagen namens Streptomyces-Phage Pablito, der aus einer Bodenprobe in den Niederlanden isoliert wurde.Dieser Phage gehört zur Gattung Janusvirus innerhalb der Unterfamilie Arquattrovirinae.Phage Pablito ist ein gemäßigter Phage mit einem ikosaedrischen Kapsidkopf von 56,1 ± 1,3 nm und einem langen, nicht kontraktilen Schwanz von 163,5 ± 0,4 nm.Abschließend stellen wir eine vollständige Genomanalyse dieses neu identifizierten Phagen zur Verfügung.Zusammen beleuchten diese Ergebnisse die Phagentaxonomie und können das Wissen über Phagen-Streptomyces-Wechselwirkungen in der Zukunft erweitern.Phage Pablito wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die aus dem Nationalpark Zuid-Kennemerland in den Niederlanden (N52°23'31″, E4°34′49″) entnommen wurde.Dazu wurden 0,5 g Erde mit Sporen des S. lividans-Wirtsstamms 1326 in 10 ml Difco Nutrient Broth (DNB) (BD Biosciences), ergänzt mit 0,5 % Glucose und 4 mM Ca(NO3)2, gemischt und über Nacht bei 30 inkubiert °C, unter Schütteln bei 130 U/min.Nach 24 h wurde die Kultur für 10 min bei 4000 g zentrifugiert und der Phagen enthaltende Überstand wurde durch einen 0,22 &mgr;m Filter (Millipore) filtriert.Anschließend wurde der Überstand auf eine DNB-Agarplatte ausgestrichen, gefolgt von einem Overlay (in DNB-Weichagar) mit 103 Sporen ml-1 von S. lividans.Die Platte wurde 24–48 h bei 30 °C inkubiert, bevor die Plaquebildung beurteilt wurde.Einzelne Plaques wurden gereinigt, indem sie zweimal auf eine frische Doppelagar-Überschichtungsplatte gestrichen wurden, die den bakteriellen Wirt enthielt.Hochtitrige Einzelvirusvorräte wurden erhalten, indem gereinigte Plaques gepickt und 10 Minuten lang mit S. lividans in DNB-Medium inkubiert wurden, bevor sie auf DNB-Doppelagarplatten ausplattiert wurden.Virale Lysate wurden gesammelt, indem die Platte mit 24 ml DNB geflutet und die Platte 2 h lang leicht geschüttelt wurde.Der Überstand wurde durch einen 0,22-um-Filter filtriert.Gesammelte Phagen wurden bei 4°C gelagert.Das Wirtsspektrum des Phagen Pablito wurde unter Verwendung von Reihenverdünnungen auf Doppelagar-Overlay-Platten bestimmt.Kurz gesagt, 3 µl der Phagenverdünnung wurden doppelt auf einen Bakterienrasen verschiedener Streptomyces- und Kitasatospora-Stämme aus der Microbial Biotechnology (MBT)-Sammlung der Universität Leiden12 getüpfelt, die eine hausinterne Sammlung isolierter Actinomyceten darstellt.Die Platten wurden mindestens 24 h bei 30 °C inkubiert, bevor eine Lyse beobachtet wurde.Als positives Ergebnis wurde das Vorhandensein einer Lysezone gewertet.Die Plattierungseffizienz (EOP) für einen gegebenen Stamm wurde relativ zum Wirtsstamm S. lividans berechnet, wenn Plaques beobachtet wurden.Eine einstufige Wachstumskurvenanalyse wurde dreifach durchgeführt, um die Latenzzeit und die Größe des Phagenausbruchs zu berechnen13.Kurz gesagt, 105 Sporen ml-1 von S. lividans wurden in 10 ml DNB-Medium bei 30 °C für 5 h keimen gelassen.Bei T = 0 wurde die Kultur mit dem Phagen Pablito bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) = 0,01 infiziert und 100 &mgr;l wurden in 10-Minuten-Intervallen bis zu 180 Minuten entnommen.Die Proben wurden filtriert, verdünnt und sofort auf Doppelagarplatten ausplattiert.Die Burst-Größe wurde anhand der folgenden Formel berechnet:Die thermische Stabilität des Phagen Pablito wurde durch Inkubation von 1 ml Lysat (106 PFU ml−1) bei 25, 30, 37, 45, 55 und 65 °C bestimmt.Die Proben wurden nach 1 h Inkubation filtriert und sofort auf Doppelagarplatten ausplattiert, um den Phagentiter zu bestimmen.Zur pH-Stabilität wurden 10 µl einer Phagen-Pablito-Suspension (106 Phagen ml−1) zu 990 µl DNB-Medium gegeben, das mit 6 M HCl oder 1 M NaOH auf verschiedene pH-Werte (2–9) eingestellt wurde.Die Röhrchen wurden dann 1 h lang bei 30 °C inkubiert, bevor die Proben durch einen 0,22-µm-Filter filtriert und unter Verwendung der Doppel-Agar-Overlay-Methode plattiert wurden.Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt.Die DNA des Phagen Pablito wurde unter Verwendung des Phage DNA Isolation Kit von Norgen (Thorold, Kanada) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert.Nach der Isolierung wurden mehrere Proben gepoolt und die DNA wurde unter Verwendung des Concentrator Plus (Eppendorf) für 20 min konzentriert.Die Gesamtgenomsequenzierung und De-novo-Assemblierung des Phagen Pablito wurde von BaseClear unter Verwendung von Illumina NovaSeq PE150-Sequenzierung mit einer mittleren Abdeckung von 118,21 (Leiden, Niederlande) durchgeführt.Die vollständige Genomsequenz des Streptomyces-Phagen Pablito wurde bei der GenBank unter der Zugangsnummer OK412919 hinterlegt.Eine lineare Karte des Genoms wurde von Geneious Prime 2020.1.2 erstellt und PhageTerm wurde verwendet, um die Genomenden zu bestimmen14.Eine phylogenetische Analyse wurde unter Verwendung der mutmaßlichen Proteinsequenz des Hauptkapsidkopfproteins durchgeführt.Die Proteinsequenzen der Streptomyces-Phagen Janus, Hank144, Pablito und Joe wurden von NCBI erworben und unter Verwendung von MUSCLE15 ausgerichtet.Ein Maximum-Likelihood-Stammbaum wurde durch Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version X (MEGAX) konstruiert, wobei 100 Bootstrap-Replikate verwendet wurden, um die Gattung des Phage Pablito abzuschätzen.Zwei mit Phagen Pablito infizierte Flüssigkulturen von S. lividans wurden filtriert, vereinigt und über Nacht mit 5 × PEG-Lösung (20 % PEG8000 in 2,5 M NaCl) bei 4 °C ausgefällt und 70 min bei 3500 g zentrifugiert, wonach der Überstand verworfen wurde .Von dem verbleibenden Pellet wurden 3 &mgr;l auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter (EMS) mit einer Maschenzahl von 200 mit Glimmentladung gegeben und 30 s stehen gelassen, bevor überschüssige Probenlösung durch Filterpapier entfernt wurde.Die Phagen wurden mit 2 % Uranylacetat für 45 s gefärbt und für weitere 30 min luftgetrocknet.Die Gitter wurden unter Verwendung eines einzelnen geneigten Probenhalters in einem 120-kV-Talos-L120C-TEM mit einer Lab6-Elektronenquelle und einem Ceta-Detektor am Niederländischen Zentrum für Nanoskopie (NeCEN, Leiden) beobachtet.Bakteriophage Pablito produzierte klare kleine Plaques auf dem S. lividans-Wirtsstamm unter Verwendung der Doppelagar-Überschichtungsmethode (Fig. 1a).Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um die Morphologie des Phagen Pablito aufzudecken.Dies zeigte, dass der Phage Pablito einen ikosaedrischen Kapsidkopf von 56,1 ± 1,3 nm (n = 3) und einen langen, nicht kontraktilen Schwanz von 163,5 ± 0,4 (n = 3) hat (Abb. 1b).Der lange, flexible Schwanz zusammen mit dem ikosaedrischen Kapsidkopf war der erste Hinweis darauf, dass es sich bei diesem Phagen um ein Siphovirus handelt, das zur Klasse der Caudoviricites gehört, was durch Gesamtgenomsequenzierung weiter bestätigt wurde (siehe unten).Morphologie des Phagen Pablito.(a) Plaque-Morphologie des Phagen Pablito nach 24 h Infektion in S. lividans unter Verwendung der DNB-Doppelagar-Overlay-Platte.(b) Repräsentative TEM-Bilder des Phagen Pablito.Phagenpartikel wurden mit 2 % Uranylacetat gefärbt.Ein Host-Range-Assay an 10 Aktinomyceten ergab, dass alle acht getesteten Streptomyces-Stämme durch den Phagen Pablito infiziert werden konnten (Tabelle 1).Abhängig vom Wirtsstamm zeigten einige Lysezonen eine trübe Morphologie, die für mehrere Streptomyces-Phagen üblich ist16, und war der erste Hinweis darauf, dass der Phage Pablito ein gemäßigter Phage sein könnte.Der EOP für einen Stamm relativ zum Wirtsstamm S. lividans, aus dem der Phage isoliert wurde, wird angegeben, wenn Plaques zählbar waren.Im Gegensatz dazu gehören die beiden nicht infizierten Arten (dh MBT66 und K. viridifaciens) zur Schwestergattung Kitasatospora, Mitglieder der Aktinomyceten, die Streptomyces morphologisch ähnlich sind, aber allgemein nach ihrer Resistenz gegen Streptomyces-Phagen klassifiziert werden17,18.Die Sequenzierung des gesamten Genoms und die De-novo-Assemblierung des Phagen Pablito ergaben ein doppelsträngiges DNA-Genom mit 49.581 Basenpaaren.Während sein Wirt S. lividans einen relativ hohen G + C-Gehalt von 72 % hat, hat der Streptomyces-Phage Pablito einen G + C-Gehalt von 66,4 % und ein 3'-kohäsives Ende von CGCCGTGTCTT (Abb. 2).Das Genom enthält 76 potenzielle kodierende Sequenzen (CDSs), von denen 50 für hypothetische Proteine ​​kodieren, während die Funktion von 26 CDSs vorhergesagt werden konnte.Letztere wurden als Morphogeneseproteine, Nukleotidstoffwechsel- und DNA-Replikationsproteine, lysogenes Modul und ein bakterielles Lyseprotein kategorisiert, wie in Fig. 2 angegeben.Schematische Darstellung des dsDNA-Genoms des Streptomyces-Phagen Pablito.Pfeilspitzen sind in Richtung des CDS angegeben.Hypothetische Proteine ​​sind gelb dargestellt und der Farbcode für vorhergesagte Proteine ​​ist wie folgt: grün für Nukleotidstoffwechsel und DNA-Replikation, orange für Morphogenese, rot für Lysogenese und dunkelblau für bakterielle Lyse.Die grüne Linie stellt den AT-Gehalt dar, während die blaue Linie den GC-Gehalt darstellt.Die Genomkarte wurde mit Geneious Prime 2020 1.2 erstellt.Die phylogenetische Analyse ( 3a ) basierend auf dem mutmaßlichen Hauptkapsid-Kopfprotein ergab, dass der Streptomyces-Phage Pablito dem Streptomyces-Phagen Janus und dem Streptomyces-Phagen Hank144 ähnlich ist, während der Streptomyces-Phage Joe entfernter verwandt ist.Basierend auf den Kriterien des Bacterial Viruses Subcommittee gilt 70 % Nukleotididentität als Grenzwert für Gattungen, während 95 % Identität Phagen derselben Art zuordnet19.Wie durch den intergenomischen Distanzrechner VIRIDIC20 berechnet, zeigt der Streptomyces-Phage Pablito eine Verwandtschaft von 70,0 bzw. 72,5 % mit den Streptomyces-Phagen Janus und Hank144 (Abb. 3b).Da die Verwandtschaft des Streptomyces-Phagen Pablito weniger als 95 % beträgt, wird dieser Phage laut dem International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)20 als neue Art betrachtet.Da der Streptomyces-Phage Janus und der Streptomyces-Phage Hank144 beide gemäßigte Phagen sind und die Sequenzierung des gesamten Genoms das Vorhandensein eines Serin-Integrase-Proteins im Streptomyces-Phagen Pablito zeigte, schließen wir daraus, dass der Phage Pablito ebenfalls ein gemäßigter Phage ist21.Zusammen zeigen diese Daten, dass der Streptomyces-Phage Pablito eine neu entdeckte Art ist, die in die Gattung Janusvirus aufgenommen werden kann.ICTV wurde ein taxonomischer Vorschlag zur offiziellen Anerkennung des Phagen Pablito als Teil der Gattung Janusvirus als neue Art namens „Janusvirus Pablito“ vorgelegt.Die Actinobacteriophage Database (https://phagesdb.org/) platziert den Phagen Pablito in Cluster BD, Subcluster BD2.Außerdem ist der Phage Pablito peripher verwandt mit zwei Prophagen, die im Streptomyces finlayi-Stamm NBSH44 und im Streptomyces venezuelae-Stamm ATCC 14583 gefunden werden.Der Streptomyces-Phage Pablito gehört zur Unterfamilie Arquattrovirinae, Genus Janusvirus.(a) Evolutionsgeschichte des Phagen Pablito, basierend auf dem Hauptkapsidkopfprotein.Insgesamt 100 Bootstraps-Replikate wurden verwendet, um den Maximum-Likelihood-Baum in MEGA.X zu berechnen.(b) Von VIRIDIC20 berechnete Heatmap, um die paarweise intergenomische Distanz/Verwandtschaft zwischen Phagengenomen zu zeigen.Genome des Streptomyces-Phagen Janus (NC_054660.1) und des Streptomyces-Phagen Hank144 (NC_054661.1) wurden verwendet, um die Verwandtschaft zu zeigen, während das Genom des Streptomyces-Phagen Joe (NC_054674.1) als Ausreißer verwendet wurde.Es wurde festgestellt, dass die Adsorption von Streptomyces-Phagen für Keimlinge maximal ist16.Wir inkubierten daher S. lividans-Sporen zuerst für 5 h in DNB-Medium, bevor wir die Kultur mit Bakteriophagen infizierten.Die einstufige Wachstumskurve des Phagen Pablito zeigte eine relativ lange Latenzzeit von 80 min mit einer Burst-Größe von 22 Virionen pro Zelle (Abb. 4).Allerdings wurde etwa nach 150 Minuten ein weiterer Anstieg des Virustiters beobachtet, der auftreten kann, wenn mehrere Phagen an eine gekeimte Spore binden, als Zeichen einer verzögerten Adsorption oder als Hinweis auf einen lysogenen Infektionszyklus22.Der höchste erhaltene Titer lag nach 24 h bei etwa 106 PFU ml−1.Ein unterschiedlicher MOI-Bereich, längere Inkubationszeiten und sogar das Überfluten einer konfluenten Plaqueplatte führten nicht zu einer Erhöhung der Gesamtzahl an Phagen ml-1.Einstufige Wachstumskurve.Bei MOI = 0,01 hatte der Phage Pablito eine Latenzzeit von 80 min und einen zweiten Burst bei 150 min mit einer Gesamtburstgröße von 22 Virionen pro Zelle.Wir bewerteten auch die Wirkung von Temperatur und pH-Wert auf die Lebensfähigkeit der Phagen.Der Phage Pablito war bis zu 45 °C ohne Verringerung der Lebensfähigkeit stabil (Abb. 5a).Die Infektiosität nahm jedoch signifikant ab, wenn der Phage für eine Stunde bei 55 °C oder höher inkubiert wurde.Phage Pablito war bei pH 7,0–9,0 relativ stabil, während die Infektiosität stark abnahm, wenn der pH-Wert unter 6,0 lag (Abb. 5b).Bei pH-Werten unter 4,0 wurden keine Plaques gefunden, während bei pH-Werten von 5,0 und 6,0 ​​nur eine geringe Aktivität erhalten blieb.Stabilität des Phagen Pablito.(a) Phage Pablito bleibt bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 45 °C relativ stabil, bei höheren Temperaturen wird jedoch eine verringerte Stabilität beobachtet.(b) Die Phagenstabilität war bei pH 7,0 und höher optimal.Ein signifikanter Abfall der PFUs wurde bei pH ≤ 6,0 beobachtet.Diese Studie stellt den Streptomyces-Phagen Pablito als gemäßigten Siphophagen vor, der in der Lage ist, verschiedene Streptomyces-Stämme zu infizieren.Genomanalysen und TEM-Bilder zeigten, dass dieser Phage als neue Art in der Gattung Janusvirus innerhalb der Unterfamilie Arquattrovirinae klassifiziert werden könnte.Mitglieder dieser Unterfamilie/Gattung haben lange, nicht kontraktile Schwänze und ikosaedrische Kapsidköpfe.Phage Pablito zeigte eine Burst-Größe von 22 Virionen pro Zelle und war bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 45 °C und einem pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0 stabil.Dieser Phage kann in zukünftigen Studien verwendet werden, um ein neues Licht auf die Wechselwirkungen zwischen Bakteriophagen und Streptomyces zu werfen und aufzudecken, wie dieser Phage die Bodengemeinschaft beeinflusst.Das Genom des Streptomyces-Phagen Pablito ist auf NCBI (GenBank-Zugriffsnr. OK412919) erhältlich.Fernández-Martínez, LT et al.Neue Einblicke in die Biosynthese von Chloramphenicol in Streptomyces venezuelae ATCC 10712. Antimicrob.Agenten Chemother.58, 7441–7450 (2014).de Pocópio, REL et al.Von Streptomyces produzierte Antibiotika.Braz.J. Infizieren.Dis.16, 466–471 (2012).Zheng, J., Li, Y., Guan, H., Zhang, J. & Tan, H. Steigerung der Neomycin-Produktion durch Engineering des gesamten biosynthetischen Genclusters und Fütterung wichtiger Vorläufer in Streptomyces fradiae CGMCC 4.576.Appl.Mikrobiol.Biotechnologie.103, 2263–2275 (2019).Hwang, K.-S., Kim, HU, Charusanti, P., Palsson, B. Ø.& Lee, SY Systembiologie und Biotechnologie von Streptomyces-Spezies zur Produktion von Sekundärmetaboliten.Biotechnologie.Erw.32, 255–268 (2014).van Wezel, GP & McDowall, KJ Die Regulierung des Sekundärstoffwechsels von Streptomyces: Neue Verbindungen und experimentelle Fortschritte.Nat.Prod.Rep. 28, 1311–1333 (2011).Alstyne, MHV, Otto, RH & McCoy, E. 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